I-PRINCIPE

La Poly Chain Reaction (PCR) consiste en l'amplification exponentielle d'un fragment d'ADN par copies multiples à l'aide d'amorces (petites séquences d'oligonucléotidiques) et d'une enzyme, l'ADN polymérase (figure 1), mise au point en 1985 par Karry Mullis. Elle permet de repérer un fragment d'ADN ou de gène précis, même présent en quantité infime dans un mélange, puis de le multiplier rapidement. La PCR utilise de manière répétitive la propriété des ADN polymérases de ne pouvoir synthétiser un brin complémentaire d'ADN qu'à partir d'une amorce.
La PCR repose sur trois étapes qui sont indispensables pour toute synthèse d'ADN et qui sont répétées plusieurs fois : dénaturation, hybridation, élongation. Tous les éléments nécessaires à la réaction sont regroupés dans un tube qui sera soumis aux différentes températures correspondant à chaque étape. Ces cycles de température sont réalisés automatiquement dans un thermocycleur.
La dénaturation : Comme l'ADN contenant le fragment à amplifier est généralement sous forme double-brin, il doit être dénaturé en simples brins. L'ADN monocaténaire est obtenu par chauffage à 94°C qui entraîne l'ADN double brin à se séparer en deux simples brins.
L'hybridation entre les amorces spécifiques de l'ADN à amplifier et cet ADN simple brin, se fait du côté 3' par complémentarité des bases. Deux amorces, sens et anti-sens sont préparées. Ce sont de petits brins d'ADN d'environ 20 bases, (les oligonucléotides) capables de s'hybrider de façon spécifique, grâce à la complémentarité des bases, sur le brin d'ADN ou sur son brin complémentaire. Les amorces sont choisies de façon à encadrer la séquence d'ADN à amplifier. La température d'appariement couramment utilisée est entre 50 à 70°C et dépend de la longueur et de la composition en bases de l!amorce.
Pour obtenir l'hybridation, la température est rapidement abaissée à 55°C. Les amorces "reconnaissent" leur séquence complémentaire sur les brins d'ADN cibles. Elles s'hybrident chacune sur son brin respectif. Cette étape dure une minute pour laisser le temps aux amorces de s'hybrider correctement. L'ADN total étant plus long, n'aura pas le temps de se réhybrider.
L'élongation fait intervenir :
-la Taq Polymerase (Taq Pol) (ADN polymérase thermorésistante extraite de la bactérie Thermus aquaticus) : sa température optimale d'action est de 72°C et elle est capable de résister à des passages successifs à 95°C ce qui a rendu possible l'automatisation de la procédure.
-les 4 nucléotides : dGTP, dATP, dTTP, dCTP appelés dNTPs (DésoxyNucléotides-Tri-Phosphates), sont les éléments de bases utilisés par la Taq Pol pour synthétiser les brins d'ADN complémentaires qui se réalisent par réaction enzymatique avec une ADN polymérase.
L'association d'un brin et d'une amorce est le subtrat de l'ADN polymérase Taq1 pol, qui avec l'apport de nucléotides extérieurs, permet la synthèse du brin complémentaire. Cette extension se fait à partir de l'extrémité 3' où se situe l'amorce, à une température de 72°C. A la fin de l'élongation, on obtient un duplex ADN, brin ancien/brin néo-synthétisé.
Ces trois étapes représentent un cycle et on peut répéter autant de fois que nécessaire ce cycle. Un premier cycle permet de synthétiser autant de brins complémentaires (plus courts puisque bornés par une amorce) que de brins cibles présents dans le tube. Ils deviennent à leur tour des ADN cibles. Lors d'un deuxième cycle, la quantité d'ADN continue de doubler et les premiers brins dont la taille est limitée par les deux amorces, font leur apparition. Au 3ème cycle apparaissent les premiers amplicons, ADN double-brins bornés par les amorces, correspondant au fragment d'ADN recherché. La taille des fragments varie généralement de 50 paires de bases (pb) à 2 kilobases (Kb).

Au fil des cycles la quantité d'amplicons va augmenter de façon exponentielle. La quantité d'ADN est multipliée par deux à chaque cycle. On obtient, théoriquement 2n copies pour n cycles. Dans la pratique, pour un rendement de 85%, une PCR de 30 cycles produit environ 1 000 000 copies (amplicons de taille prévue). On peut encore exprimer les résultats en disant qu'au bout de n cycles, la quantité initiale Ao d'ADNc cible devient : An = Ao X 2n.
En théorie, après 20 cycles, il y a environ un million de copies, après 30 cycles environ un milliard de copies de la séquence d'ADN cible.

II-MATERIEL

Cette réaction nécessite des oligonucléotides (amorces) s'hybridant avec les extrémités 3' de la portion de la séquence à amplifier, une enzyme, des nucléotides ou dNTP (déoxynucléotides tri-phosphates) = dATP+dGTP+dTTP+dCTP et un milieu de réaction dont la concentration en Magnésium sous forme de MgCl2 est un élément clef de l'efficacité de la réaction.
L'enzyme assurant l'amplification est une ADN polymérase dont la plus utilisée est la Taq polymérase .
Les produits de PCR colorés par du bleu de bromochloroindolophosphate (BCIP) sont déposés sur un gel d'agarose contenant du bromure d'éthidium. Après l'électrophorèse qui sépare les produits de PCR, le gel est exposé aux UV. Le Bromure d'Ethidium (BEt), produit intercalant qui se glisse entre les bases des acides nucléique, lorsqu'il est intercalée, présente une fluorescence orange sous illumination par des UV courts (environ 300 nm).
Cette électrophorèse permet de faire migrer les acides nucléiques au travers du gel additionné de BEt. La vitesse de migration étant dépendante de la masse moléculaire, donc du nombre de bases de l'ADN testé, la présence et la taille des amplicons pourront être vérifiés. Le poids moléculaire est déterminé grâce à un témoin de poids moléculaire de bases.

Il existe actuellement plusieurs modèles d'appareils de PCR ou "thermocyclers" qui assurent automatiquement "les cycles" et permettent de travailler sur un grand nombre d'échantillons.

III-INCONVENIENT ET LIMITE DE LA TECHNIQUE

Le principal inconvénient de la PCR est la contamination aisée du milieu réactionnel par d'autres ADN. On remédie à ce problème en utilisant des pointes de pipettes automatiques à filtre pour empêcher la formation d'aérosols et en travaillant dans un lieu où peu de préparations d'ADN sont réalisées en parallèle.
La limite essentielle de la technique est qu'il est difficile de la rendre quantitative. Mais, on peut remédier à cette limite en ayant recours à la technique de PCR par compétition.

IV-PCR PAR COMPETITION

Cette méthode est basée sur une réaction de PCR en présence d'ADN compétiteur ou standard interne. La séquence du standard interne est choisie de façon à permettre la séparation des produits de PCR.
L'efficacité d'amplification du compétiteur est la même que celle de l'ADNc cible. Au bout de n cycles, la quantité initiale du compétiteur Co devient : Cn = Co X (1+e)n
Le rapport Cn/An permet de déterminer Ao : Cn = Co (1+e)n Soit : Cn = Co (Eq1)
An Ao (1+e)n An Ao
Co étant connue, en déterminant Cn/An à la fin de la PCR, on obtient Ao.
Les produits de PCR sont séparés par électrophorèse sur un gel agarose 3%. A la fin de la migration, le gel exposé aux UV, est photographié. Le négatif est ensuite analysé au densitomètre (la quantité de bromure d'éthidium incorporée dans une bande étant proportionnelle à la quantité d'ADN, le rapport des surfaces des pics de chaque piste représente le rapport des concentrations Cn /An ).

La méthode de PCR est également employée pour doser des ARNm et on parle alors de transcription inverse-PCR.

V-TRANSCRIPTION INVERSE-PCR OU RT-PCR

Cette réaction consiste en une synthèse de l'ADN complémentaire (ADNc) de l'ARNm étudié par transcription inverse (RT), puis en une amplification de cet ADNc par la technique de PCR. La synthèse de l'ADNc s'effectue avec une ADN polymérase ARN dépendante et une amorce anti-sens responsable de la spécificité en s'appariant à sa séquence complémentaire de l'ARNm cible. L'enzyme la plus utilisée est la Tth polymérase, isolée de la bactérie Thermus thermophilus.. Le milieu de RT, "RNAse free" contient du manganèse sous forme de MnCl2 et des dNTP.
Les limites de la technique sont :
- L'intégrité des ARN qui doit être vérifiée sur un gel agarose 1%, coloré au bromure d'éthidium avec la présence de deux bandes (ARN ribosomiaux 28S et 18S).
- L'absence de traînées en particulier sous la bande 18S, et un rapport d'intensité des bandes 28S/18S d'environ 2, garantissent l'intégrité des ARN.
- Le dosage des ARN s'effectue au spectrophotomètre (1 DO260 = 40 µg d'ARN/ml).
La contamination protéique est déterminée en fonction du rapport des DO à 260 et à 280 nm. Le rapport pour un "ARN" pur doit être compris entre 1,7 et 2.
- Une autre limite est de doser de faibles quantités ou de faibles variations d'ARNm.
On a alors recours à la technique de RT-PCR par compétition, basée sur une réaction de réverse transcription suivie d'une réaction de polymérisation en chaîne en présence d'ADN compétiteur ou standard interne (figure 2).

VI-PUCE ADN

Les mesures d'expression des gènes se font grâce à l'utilisation de réseaux d'ADN ou puces ADN.
Ces mesures reposent sur l'hybridation entre un mélange d'ADNc marqués préparé à partir d'ARNm de l'échantillon et un ensemble de segments d'ADN de séquence connue (tantôt nommé cibles, tantôt sondes selon les auteurs) fixé sur un support.