I- ANIMAUX TRANSGENIQUES

Il est possible d'introduire des gènes clonés dans des oeufs fertilisés de différentes espèces, notamment de souris. Ces oeufs sont ensuite réimplantés dans l'oviducte de femelles pseudogestantes. Chez un pourcentage assez faible des naissances obtenues, les animaux sont porteurs du gène, on les dit transgéniques.
La méthode d'introduction du gène consiste à l'injecter dans un pronucleus de l'oeuf.
Le procédé pour produire une souris transgénique fait appel aux étapes décrites ci-dessous.

I-1. Préparation de l'ADN transgénique

L'ADNc choisi est, par exemple, placé entre une structure "promoteur" et une structure "enhancer". Ainsi un gène peut s'exprimer dans les cellules T, si l'ADNc est intercalé entre le promoteur et l'enhancer des gènes de la chaîne ß des TR. Le promoteur est la région de l'ADN responsable de la liaison avec l'ARN polymérase lors de l'initiation de la transcription. L'enhancer accroît la synthèse de l'ARNm dépendant du promoteur.

I-2. Obtention des oeufs fertilisés

Une hyperovulation est induite chez des femelles par un traitement hormonal (FSH, puis après 48 h, hCG). Ces femelles sont en contact avec des mâles fertiles juste après l'injection d'hCG. Une douzaine d'heures plus tard, les oviductes sont prélevés et les oeufs fertilisés mis en suspension dans du milieu de culture après traitement par une solution d'hyaluronidase (Figure 1).

I-3. Injection de l'ADN transgénique dans le pronucléus

On utilise une pipette dont l'orifice est plus étroit que le diamètre des oeufs. A l'aide de cette pipette, on immobilise un oeuf par aspiration, puis on injecte, grâce à une micropipette, une solution d'ADN transgénique (2 picolitres contenant 200 à 500 copies) dans le pronucléus mâle. La réussite de la micro-injection est objectivée par un accroissement temporaire de taille du micronucléus (Figure 1).

I-4. Transfert des oeufs injectés avec l'ADN dans l'oviducte des femelles pseudogestantes

Une pseudogestation est provoquée chez les femelles à la suite d'un accouplement avec des mâles stérilisés par vasectomie.
Une pipette dont le diamètre est un peu supérieur à celui des oeufs, permet d'en prélever 20 à 30 et de les implanter dans un oviducte d'une femelle pseudogestante après piqure au travers de sa paroi (Figure 1). Chaque femelle permet d'obtenir 20 à 40 oeufs fertilisés. Dix à 20% des oeufs implantés donnent naissance à des souris dont seulement 10 à 30% sont transgéniques. Ces souris transgéniques accouplées à des souris normales donnent 50% de F1 transgéniques, parfois plus si le gène s'est intégré dans plusieurs sites chez une même souris parent transgénique.

II-ANIMAUX AVEC GENES MUTES PRODUITS PAR RECOMBINAISON HOMOLOGUE

La recombinaison homologue est le phénomène qui fait intervenir un échange entre deux fragments d'ADN présentant des homologies de séquence. On peut ainsi muter un gène au sein d'un génome.
Dans les cellules de mammifères, l'intégration d'un ADN exogène se fait le plus souvent au hasard au niveau de sites non spécifiques. Une fois sur 1000, l'ADN exogène se combine à son homologue sur le chromosome et peut le remplacer, c'est la recombinaison homologue (RH). L'inactivation d'un gène par RH ou knock out peut se faire, soit par duplication partielle de ce gène in situ, soit par remplacement de l'ADN endogène par l'ADN exogène.
Cette méthode permet d'obtenir des animaux dont un gène ne s'exprime plus (figure 2). Pour cela, on utilise des cellules murines embryonnaires ES obtenues à partir des cellules des blastocystes. Ainsi, différentes lignées de cellules ES sont disponibles.
On réalise alors une transfection avec l'ADN voulu chez l'une de ces lignées. on sélectionne ensuite les cellules transfectées, par exemple grâce à leur résistance à la néomycine si on a utilisé un ADN portant comme marqueur, le gène de la phosphotransférase de la néomycine. Les cellules transfectées, dont la recombinaison est homologue, sont identifiées par PCR. Ces cellules sont enfin injectées dans un blastocyste de souris. Elles participeront ensuite à la constitution de l'embryon issu de ce blastocyste. Une souris chimère ou mosaïque, faite de cellules dont le gène étudié est soit muté, soit normal, naitront de cet embryon. Le croisement de ces souris chimères permet d'obtenir des souris dont toutes les cellules portent des gènes mutés. Lorsque la mutation est récessive, ce qui est fréquent, il faut des croisements successifs pour que des souris expriment phénotypiquement la mutation.