ANNEXE IV

CYTOMETRIE EN FLUX

 

I-PRINCIPE

La cytométrie en flux est une technique d'analyse multiparamétrique sur plusieurs milliers de cellules isolées. Les mesures simultanées de caractéristiques physiques et biologiques sont effectuées isolément sur chacune d'entre-elles lorsque, entraînée par un fluide au centre d'une veine liquide, elle traverse la source d'excitation lumineuse (
faisceau laser). Après intersection du rayon incident, la cellule diffracte la lumière. L'intensité de la lumière diffractée dans l'axe (angle < 12°), est proportionnelle à la taille de la cellule (FSC : forward scatter); celle diffractée à 90° est représentative de son contenu cytoplasmique (SSC : side scatter). Les signaux détectés par le système optique sont amplifiés, convertis en signaux électroniques puis en valeurs numériques. Elles sont analysées grâce à l'unité informatique du cytofluorimètre. L'affichage simultané des paramètres, FSC, SSC traités par le logiciel, visualise chaque cellule sur écran sous forme de point. C'est le cytogramme, nuage de signaux punctiformes qui apparaît(figure). Selon les deux paramètres, il est possible de distinguer différentes populations cellulaires et de tracer le contour de la population à étudier en excluant d'une part les débris sur les critères de petite taille (FSC) et petite granularité (SSC) et d'autre part les aggrégats situés très haut dans la partie supérieure de l'écran. La zone d'intérêt ainsi délimitée (appelée fenêtre ou région) est la population cellulaire homogène. Seules les valeurs concernant cette région sont analysées par l'emploi du logiciel. D'autres paires de signaux comme FSC et Fluorescence peuvent être considérées, de nouveaux points apparaissent représentant chacun une cellule en fonction de sa taille et de la fluorescence qui lui est associée. La relation entre la population de la zone d'intérêt et la fluorescence nécessite une autre présentation des données. Elles sont représentées par des histogrammes de distribution de fréquence : l'axe horizontal correspond à l'étendue des canaux, l'axe vertical au nombre de cellules par canal (figure). Le nombre de canaux est de 0 à 1023 en échelle linéaire, de 0 à 104 en mode logarithmique utilisé souvent pour les mesures d'IF dont les valeurs peuvent varier de plusieurs ordres de grandeur. L'histogramme monoparamétrique de la fluorescence montre la distribution des cellules marquées. L'intensité de fluorescence au delà de laquelle les cellules sont considérées comme positives pour un Ac donné, est fixée par rapport à des témoins. Les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules marquées (nombre de cellules positives / nombre de cellules analysées).
Les mesures de taille, de contenu cellulaire, de fluorescence étant réalisées, l'exploitation de ces données permet au sein d'une population cellulaire homogène d'exprimer en pourcentages, les cellules marquées.
Le cytofluorimètre d'analyseur de cellules peut être équipé pour devenir trieur de cellules. Les cellules repérées sont déviées vers un tube collecteur et ainsi isolées. La déflection est réalisée en utilisant des gouttelettes chargées électriquement dans lesquelles se situent les cellules et sont déviées par un champ électrique permettant ainsi le regroupement de sous-populations cellulaires pures.

II-DONNEES TECHNIQUES

Le laser produit une lumière monochromatique qui excite spécifiquement un fluorochrome à une longueur d'onde donnée .
Le plus utilisé est à
ion argon qui émet une lumière à une longueur d'onde de 488 nm.
De nombreux fluorochromes peuvent être excités à cette longueur d'onde et l'on peut ainsi étudier plusieurs paramètres cellulaires.
D'autres lasers argon peuvent être utilisés de longueur d'onde différente. On peut également faire appel à un second laser (
xénon, krypton, hélium-néon, hélium- cadmium) pour augmenter la gamme des fluorochromes utilisables simultanément.
Les fluorochromes sont des substances capables quand elles reçoivent un rayonnement incident d'une certaine longueur d'onde de réémettre lors de leur déexcitation électronique une radiation de longueur d'onde supérieure.
Les fluorochromes se peuvent se fixer directement sur un élément cellulaire comme ADN, ARN, protéines, calcium ou être conjugués à un anticorps spécifique d'un constituant cellulaire. On détermine alors les pourcentages de cellules marquées et la quantité de l'élément étudié présent dans les cellules, grâce à l'intensité du marquage. En effet, l'intensité de la fluorescence émise est proportionnelle à la quantité de cet élément.

La détection de plusieurs paramètres n'est limitée que par les sources d'excitation disponibles. Ainsi, sont souvent utilisés l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et la phycoérythrine R (PE) qui sont excitables à la même longueur d'onde, mais qui émettent à 2 longueurs d'onde bien séparées permettant ainsi de récupérer 2 signaux différents (tableau).
Le nombre de cellules nécessaire est de 500.000 cellules au minimum. On doit augmenter ce nombre si la population étudiée représente moins de 1 % de la population totale enregistrée.
Sur l'histogramme, est placé un seuil au delà duquel les cellules sont considérées comme positives par rapport à un contrôle de fluorescence sans Ac spécifiques, correspondant à l'autofluorescence propre à chaque type de cellule et au fixateur utilisé, ainsi qu'à la fixation non spécifique du conjugué sur ces cellules.

III-EXEMPLES D'APPLICATIONS

* cycle cellulaire
* caryotype en flux
* tri des chromosomes (cartographie des gènes)
* fluidité membranaire (lipides et protéines conjugués à un fluorochrome)
* classification des cellules hématopoïétiques par leur phénotype membranaire et leur contenu en acides nucléiques
* activité enzymatique cellulaire
* Flux calcique
* taux anormaux d'ADN dans les tumeurs
* diagnostic différentiel des désordres immunitaires...

Nous n'envisagerons que quelques unes des applications précédantes.

Etude du cycle cellulaire : Le cycle cellulaire est divisé en 4 phases principales : G1 (avant réplication ADN), S (réplication du matériel génétique) G2 (phase) M (division cellulaire). S et G2 ont des durées constantes, G1 est variable selon les populations et responsable de la variabilité de l'interphase et donc du cycle cellulaire. C'est l'analyse du contenu en ADN qui permet l'étude de la répartition des cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire. Une limite existe dans la distinction entre cellules en G2 ou M et cellules binucléées et cellules en G1 quiescentes ou différenciées.
On utilise pour ces études l'IP. Hoescht 33342 et le BrDU (analogue de la thymidine qui s'incorpore dans l'ADN en phase de synthèse)
Le double marquage par IP + BrDU permet de détecter avec l'IP, l'ADN répliqué et avec le BrDU, le taux de synthèse de l'ADN.
On peut mesurer d'autres constituants cellulaires tels que ARN/ protéines/ (volume cellule).

Etude des cellules de l'immunité : Nous ne donnerons que quelques exemples.
Les lymphocytes peuvent être caractérisés par des marquages à l'aide d'Ac monoclonaux comme les anti-CD4, -CD8, -CD3, -CD2, -CD19 ou à l'aide de colorants des acides nucléiques.
La densité d'expression de ces marqueurs peut aider à identifier des stades de maturation différents. La
figure donne l'exemple de l'utilisation de la cytométrie en flux pour l'étude des thymocytes de souris.
Dans le SIDA, la cytométrie en flux est une méthode de choix pour étudier ce syndrome immunodéficitaire caractérisé par une lymphopénie avec diminution du nombre des TCD4+ et augmentation des CD8+ aux stades initiaux.
La coloration des cellules par l'acridine orange (ADN/ fluorescence verte et ARN/rouge) permet par exemple de différencier lymphocytes et monocytes en fonction du contenu en ARN. Dans les syndromes lymphoprolifératifs, la fréquence de l'aneuploidie augmente avec le grade et le pronostic est défavorable si les cellules en phase S sont très fréquentes.
Etude des chromosomes humains :
Les cellule sont bloquées en métaphase en utilisant par exemple de la colchicine. Les mitoses s'accumulent et les chromosomes sont alors isolés et stabilisés dans un tampon à pH neutre.
Les fluorochromes les plus souvent utilisés marquent les bases de l'ADN comme le Hoescht 33258. Ainsi, la fluorescence émise par le chromosome est proportionnelle à la quantité d'ADN.
Viabilité cellulaire :
Pour déterminer le pourcentage de cellules vivantes dans une population donnée, on utilise la propriété qu'ont les cellules vivantes de fixer des colorants vitaux (rouge neutre, orange d'acridine, diacétate de fluorescéine, rhodamine) ou d'exclure la pénétration de certains colorants (bleu trypan) ou leur capacité à diffuser ou à émettre de la lumière.

 

IV-AVANTAGES

La cytométrie en flux permet :
* d'identifier une sous-population au sein d'une population hétérogène sans enrichissement préalable de cette population.
* de faire la différence entre une faible augmentation d'expression d'une molécule sur toutes les cellules ou une augmentation importante dans une sous population.
* une analyse rapide : 100 000 cellules/minute en moyenne
* d'obtenir une sensibilité de détection et une quantification supérieure à la microscopie optique, ainsi l'échelle d'intensité comprend de 256 à 1024 canaux.
* de mesurer plusieurs paramètres en utilisant des fluorochromes différents (il faut faire attention au chevauchement des spectres respectifs des fluorochromes). Des fluorochromes de plus en plus nombreux ont des spectres d'excitations proches et des spectres d'émission bien séparés, ce qui permet de n'utiliser qu'un seul laser.