En 1975, Köhler et Milstein produisent un hybridome qui sécrète des Ac monoclonaux anti-GRM (globules rouges de mouton). Pour cela, ils mélangent in vitro des cellules de rate de souris anti-GRM avec une lignée de myélome de souris (P3-X63-Ag8) et réalisent la fusion entre lymphocytes B de rate et myélome grâce à une préparation de virus Sendaï inactivés. Les lymphocytes de rate meurent rapidement en culture alors que les cellules myélomateuses persistent indéfiniment. Les cellules hybrides faites d'un lymphocyte B normal et d'une cellule myélomateuse, sécrètent les mêmes Ig Ac que synthétisait le lymphocyte B. De plus, ces hybrides sont immortels comme la lignée myélomateuse. Vont donc persister dans les cultures , les cellules myélomateuses et les hybrides.
Pour séparer les hybrides des cellules du myélome, on choisit comme lignée myélomateuse servant à l'hybridation, des cellules déficitaires en enzymes thymidine-kinase (TK) ou hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl-transférase (HGPRT) nécessaires à la synthèse de l'ADN par la voie exogène habituelle. Dans une cellule normale, la synthèse d'ADN se fait soit par la voie exogène à partir de l'hypoxanthine et de la thymidine, soit par la voie endogène de sauvegarde qui fait appel aux AA et aux sucres (figure 1).
Si l'on bloque la voie de sauvetage en introduisant de l'aminoptérine dans le milieu, les cellules myélomateuses mourront étant dépourvues de la voie exogène, alors que les hybrides utiliseront cette voie qui leur est accessible par leur moitié correspondant aux lymphocytes B normaux. Donc après la fusion, les cellules sont cultivées dans le milieu HAT (hypoxanthine, aminoptérine, thymidine) de Littlefield qui ne permet la survie que des hybridomes (figure 2).
Par rapport à la technique initiale, des améliorations ont été apportées en introduisant comme facteur de fusion du polyéthylène glycol (30 à 50%) ou un courant électrique (électrofusion).
Les myélomes fusionneurs déficitaires en TK ou HGPRT sont des mutants sélectionnés par culture dans des milieux contenant des analogues soit de la thymidine (bromodéoxyuridine), soit de l'hypoxanthine (8-azaguanine). De l'ADN anormal est synthétisé si les cellules sont respectivement TK+ ou HGPRT+. Ces cellules ne sont pas viables et ne survivent que les mutants TK- ou HGPRT- qui sont ainsi sélectionnés.
Du point de vue pratique, le protocole de production des Ac monoclonaux est le suivant (figure 3) :
* Immunisation de souris dont la dernière injection précède de 3 jours le sacrifice de l'animal.
* Prélèvement de la rate et réalisation d'une suspension cellulaire.
* Mélange de ces cellules spléniques à une culture de plasmocytome de souris TK(-) ou HGPRT(-) et adjonction de polyéthylène glycol qui permet la fusion entre cellules du mélange (en moyenne, une cellule de myélome sur 100 fusionne pour donner un hybride).
* Culture en petits puits du mélange précédent, dans du milieu sélectif HAT. Les cellules de rate meurent naturellement en 1 à 2 semaines et les cellules du myélome sont tuées par le milieu. Seuls persistent les hybrides dont un petit nombre sécrète les Ac de spécificité recherchée.
* Recherche des Ac éventuellement produits dans le surnageant des puits contenant des hybrides.
* Clonage des hybrides de chaque puits contenant des Ac, de façon à obtenir des populations cellulaires provenant d'une seule cellule hybride. Les Ac synthétisés par chaque clone sont des Ac monoclonaux identiques entre eux.
* Production des Ac monoclonaux soit par culture, soit in vivo en injectant les cellules hybrides à des receveurs compatibles qui développeront une ascite riche en Ac monoclonaux.
Les Ac monoclonaux sont principalement obtenus dans un système souris-souris (souris immunisé et plasmocytome de souris) mais ils ont aussi été produits dans les systèmes rat-rat et homme-homme.
Des résultats plus aléatoires ont été signalés à l'aide de fusions inter-espèces : souris-homme, souris-hamster, souris-lapin, souris-bovin. La stabilité des clones inter-espèces est très mauvaise, les clones cessent souvent très rapidement de sécréter les Ac. Pour limiter ce problème, les clones sont recloner et retester régulièrement.