I- INTRODUCTION

La réaction d'association entre un Ag et un Ac correspondant met en jeu des liaisons non covalentes de faible énergie, permettant la réversibilité de la réaction.
Quatre types de forces sont mises en jeu dans la liaison Ag-Ac (figure IV-1).
Ce sont, de la plus forte à la plus faible :
* forces électrostatiques ou ioniques qui s'exercent entre deux groupements ioniques de charge opposée ; par exemple NH3+ et COO-.
* liaison hydrogène, entre atomes électropositifs (hydrogène) et électronégatifs (oxygène, azote). Elles sont stabilisées par la présence d'eau et diminuent avec la température.
* liaisons hydrophobes qui se forment entre des groupements chimiques hydrophobes, qui repoussent les molécules d'eau.
* forces de Van der Waals qui s'établissent entre des groupements présentant des moments électriques dipolaires instantanés (mouvement des électrons entre deux molécules). Elles sont très peu énergétiques.
La stabilité de toutes ces liaisons non covalentes est influencée par les conditions physicochimiques du milieu. Elle est diminuée par l'augmentation de la température, de la force ionique, de l'osmolarité et l'abaissement ou l'augmentation du pH. Toutes ces modifications sont des conditions qui permettent de dissocier les complexes Ag-Ac.

La réaction Ag-Ac dépend du point de vue thermodynamique de l'affinité : force de liaison entre un épitope et son paratope. Elle est réversible et exothermique libérant de la chaleur (2 à 40KCal.M-1) :

Quand l'Ac présente une très forte affinité pour l'Ag, l'équilibre est déplacé vers la droite.

La loi d'action de masse de la réaction Ag-Ac à l'équilibre permet d'écrire ou la constante d'association est KA :

Inversement la constante de dissociation KD sera définie par la relation :

KA a les dimensions de l'inverse d'une concentration. Elle est exprimée en litre/mole.
KD a les dimensions d'une concentration. Elle est exprimée en mole/litre.

Soit M = concentration molaire en Ac
r = nombre moyen de sites Ac liés par molécule d'Ac
r'= nombre moyen de sites Ac libres par molécule d'Ac
C = concentration d'haptène libre à l'équilibre.
n = valence de l'Ac
Les équations peuvent s'écrire :

r' + r = n = valence de l'Ac.
r' = n - r

L'équation devient :

puis peut prendre la forme de l'équation du diagramme de Scatchard.


or comme n = valence de l'Ac est une constante, r/c est une fonction de r (figure IV-2)

C = mesure expérimentale de la concentration d'haptène libre que l'on fait varier pour construire la droite point par point.
Sont également mesurées la concentration totale d'haptène dans le compartiment contenant l'Ac (Mr+C) et la concentration d'Ac (M en mole/litre).
La courbe théorique est une droite qui coupe l'axe des abscisses en un point qui définit le nombre de paratopes de l'Ac, donc sa valence (2 par exemple pour les IgG). Sa pente représente la constante KA.

Lorsque l'Ag est un haptène monovalent, KD peut être déterminé expérimentalement par une technique de dialyse à l'équilibre, seuls les haptènes peuvent franchir la barrière semi-perméable séparant les 2 compartiments. Les Ac plus volumineux ne peuvent pas diffuser dans le compartiment (2). A l'équilibre, la concentration en haptènes libres dans les deux compartiments est la même.
La mesure des quantités d'haptènes en (1) et en (2) permet de déterminer la quantité d'haptènes liés aux Ac sur la courbe de Scatchard.

- La valence des Ac (n) est égale à 2 pour les IgG et 10 ou 5 pour les IgM selon les systèmes expérimentaux.
- KD varie de 10-7 à 10-13 M/l
- Les courbes expérimentales obtenues avec des Ac produits par immunisation de l'animal ne sont pas linéaires. Ceci prouve une hétérogénéité des Ac spécifiques d'un même Ag. En effet, de tels Ac sont polyclonaux reconnaissant différents épitopes sur l'Ag. Les KA sont différents pour chaque épitope et se répartissent selon une distribution gaussienne, ce qui permet de définir une constante d'association intrinsèque moyenne KAo.
Pour les Ac spécifiques d'un déterminant particulier, le KA mesure l'affinité de ces Ac.
Quand l'Ag n'est pas un haptène monovalent, mais une molécule portant plusieurs déterminants antigéniques, il est impossible de définir une constante d'association. On utilise alors le terme d'AVIDITE pour caractériser la propriété des Ac d'un sérum de se fixer plus ou moins fortement à l'Ag. Cette avidité dépend de l'affinité des Ac pour chaque déterminant mais croît aussi avec le nombre de liaisons de l'Ac avec l'Ag par exemple 2 pour les IgG mais 5 pour l'IgM et le nombre de molécules d'Ac par molécule d'Ag. Le terme d'AFFINITE est réservé aux constantes KA.

II- PRINCIPES GENERAUX DES TECHNIQUES

Les réactions Ag-Ac sont mises en oeuvre, soit pour détecter et titrer les Ac ou doser les Ag, soit pour déterminer les effets biologiques des Ac. Les méthodes suivantes permettent de les révéler :
* Les méthodes primaires permettent de montrer la fixation de l'Ac sur l'Ag indépendamment des phénomènes physiques, biochimiques ou biologiques provoqués in vitro par l'apparition du complexe Ag-Ac.
* Dans les méthodes secondaires, la fixation de l'Ac sur l'Ag est révélée par l'étude des variations des propriétés physiques, biochimiques ou biologiques provoquées in vitro par la formation du complexe Ag-Ac.
Les tests radio-immunologiques (tests RI) en phase solide ou en phase liquide type test de Farr, immuno-enzymatiques (ELISA=Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay et immunoblot) et d'immunofluorescence (IF) sont parmi les réactions primaires les plus utilisées pour apprécier qualitativement et quantitativement les Ac d'un sérum.
La précipitation en milieu gélifié (immunodiffusion en plaques d'OUCHTERLONY, électrosynérèse) et l'agglutination conditionnée sont des réactions secondaires souvent appliquées à la détection des Ac.
* Les méthodes tertiaires analysent la conséquence biologique de la réaction Ag-Ac soit in vivo, soit parfois in vitro sur des préparations cellulaires ou tissulaires. Elles font intervenir les caractéristiques propres de l'individu.
Nous indiquerons dans ce qui suit non seulement les principes des méthodes utilisées pour la recherche des Ac, mais également des méthodes immunologiques servant aux dosages de certains Ag.

II-1. Les réactions primaires

La liaison de l'Ac à l'Ag est objectivée par différentes méthodes utilisant le marquage direct des Ac ou des Ag ou celui indirect des Ac particulièrement par l'intermédiaire d'anti-Ig marquées dirigées contre ces Ac (c'est ce dernier procédé qui est généralement employé pour la mise en évidence des auto-Ac). Les Ag marqués permettent de localiser les Ac là où ils se trouvent et les Ac marqués servent à identifier in situ les Ag et à effectuer des dosages d'Ag ou d'Ac (sérum anti-immunoglobulines marquées).

II-1.1./ Marquages des Ac ou des Ag
II-1.1.1./ Marquage par un isotope radioactif (RA*)
Il existe deux types de marquage : in vivo et in vitro.
-a- Marquage in vivo
Par adjonction de précurseurs contenant des isotopes radioactifs (acides aminés, sucres, bases, etc...) à des cultures cellulaires ou bactériennes. Cela permet d'obtenir des molécules biologiques radiomarquées (RA*) non modifiées dans leur conformation ayant donc une grande identité de propriétés biochimiques et biologiques avec la molécule "naturelle" en particulier pour les propriétés immunologiques (Ag ou Ac).
-b- Marquage in vitro
* Par remplacement d'un des atomes "naturels" de la molécule par un isotope RA* tel que le tritium ou le phosphore 32.
Ainsi le tritium est introduit dans une molécule par réaction d'échange isotopique en incubant les molécules biologiques à marquer dans un milieu contenant du tritium (3H) . Dans des conditions physicochimiques définies, certains atomes d'hydrogène de la molécule seront spontanément échangés contre des 3H du milieu. Le temps de la réaction est long (plusieurs jours). Par ailleurs, la réaction inverse (échange de 3H contre 2H) peut se produire au cours de la conservation ou au cours des réactions ultérieures.
* Par introduction d'un atome nouveau RA* comme dans le marquage par l'iode 131 ou 125 :
L'iode est fixé artificiellement sur l'Ag ou l'Ac, principalement au niveau des résidus tyrosine des protéines (radical aminé) en faisant apparaître dans le milieu réactif des ions I+ qui se substituent aux H des molécules à marquer. Cependant la réaction d'oxydoréduction et la taille de l'atome d'iode peuvent altérer suffisamment les protéines pour modifier leurs propriétés antigéniques toutefois l'activité spécifique est supérieure à celle obtenue avec le tritium.
* Par "Nick Translation" (coupure-substitution) des acides nucléiques :
La méthode consiste en l'introduction de radionucléotides dans la séquence d'un ADN par exemple. Des entailles pratiquées dans l'ADN par la DNAse I permettent de remplacer les nucléotides froids qui étaient dans ces zones par des nucléotides chauds grâce à une réaction catalysée par l'ADN polymérase I.II-1.1.2./ Marquage par une enzyme
II-1.1.2.1/ Les applications de l'immuno-enzymologie
Introduite en 1966 par Avraméas et Uriel d'une part et par Nakane et Pierce d'autre part, l'immunoenzymologie s'est développée dans deux voies :
- une voie immunophysiologique : Les Ac anti-enzyme forment en présence de l'enzyme des complexes qui peuvent conserver l'activité catalytique de l'enzyme. Dans ce cas l'enzyme est à la fois l'Ag et le marqueur. On peut donc immuniser des animaux avec des enzymes et se servir des mêmes enzymes pour localiser les Ac dans les cellules, sur les immuno-électrophorèses ou sur d'autres supports des Ac.
- une voie analytique : Dans ce deuxième groupe d'applications, l'enzyme est utilisée comme marqueur par association à l'aide de liaisons covalentes ou non avec l'Ag ou l'Ac . L'agent chimique de couplage entre l'enzyme d'une part et l'Ag ou l'Ac d'autre part, ne doit pas modifier de façon notable l'activité de l'une ou de l'autre.
II-1.1.2.2/ Méthodes de couplage
Les méthodes de préparation des conjugués utilisent différents agents de couplage :
-a- couplage par le glutaraldéhyde
Le glutaraldéhyde est un aldéhyde dont les fonctions CHO se lient aux groupements aminés des lysines de l'enzyme, l'Ac ou l'Ag.
Cette méthode est plus particulièrement utilisée pour le marquage à la peroxydase.
-b- Couplage par la dimaléimide
Les groupements imides réagissent avec les groupements thiols (-SH) des protéines (Ag ou Ac) et avec ceux de l'enzyme. Cette méthode est surtout utile au couplage avec la glucose-oxydase. En cas d'absence de groupements thiols sur la molécule à marquer, on utilise le monomaléimidobenzoyl N-hydroxy-succinimide-ester dans lequel une fonction maléimide est remplacée par la fonction N-hydroxy succinimide-ester qui réagit avec les groupements -NH2.
-c- Couplage par le toluène 2-4-di-isocyanate

Il existe d'autres méthodes de couplage entre une enzyme et un Ag ou un Ac, faisant intervenir des liaisons non covalentes.
II-1.1.2.3/ Enzymes utilisées comme marqueurs et leur substrat
-a- Peroxydase du Raifort
L'enzyme déplace l'O natif d'un peroxyde (généralement H202).
* En microscopie électronique, l'O natif est révélé par la polymérisation de la 3-3' di-aminobenzidine qui devient alors insoluble, dense aux électrons et se dépose sur le lieu de la réaction.
* En microscopie optique, l'O natif peut être révélé soit par la benzidine qui forme en sa présence un précipité brun, soit par le nitroprussiate de fer qui donne alors un précipité bleu. Dans ces méthodes de microscopie, le substrat en présence de l'enzyme doit conduire à un composé insoluble qui reste en place pour permettre l'observation.
* Dosage immuno-enzymatique en phase hétérogène : l'O natif libéré du peroxyde par l'activité catalytique de l'enzyme est révélé par un changement de coloration d'un réactif sensible. Contrairement aux méthodes de microscopie, le réactif révélateur doit rester soluble pour permettre un dosage colorimétrique.
-b- Phosphatase alcaline d'Escherichia coli
Elle a les mêmes applications que la peroxydase. Le substrat habituel est un ester phosphate de ß naphtol transformé en ß naphtol que l'on révèle au cours de la réaction ou le paranitrophényl phosphate (PNPP donne PNP), soit avec un sel de di-azonium (précipité rouge visible en microscopie optique), soit avec un sel soluble de plomb (précipité noir opaque aux électrons et détectable en microscopie électronique), soit avec un ester phosphate qui change de coloration sous l'action de l'enzyme pour les dosages en phase hétérogène.
-c- Glucose oxydase d'Aspergillus niger
En présence de glucose et de l'oxygène de l'air, l'enzyme conduit à l'eau oxygénée (ou peroxyde d'hydrogène) et à l'acide gluconique.
* En microscopie électronique, la révélation se fait par action de la peroxydase du Raifort sur H202.
* Pour la microscopie optique, la réaction est révélée par un sel de tétrazonium qui forme alors un précipité bleu.
* Dosages immunoenzymatiques en phase solide, l'utilisation d'un substrat changeant de couleur sous l'action catalytique de l'enzyme permet d'effectuer un dosage colorimétrique.
II-1.1.3./ Marquage par un fluorochrome
Ce type de marquage permet de réaliser des réactifs utilisés en immunocytochimie, immunohistochimie et cytométrie de flux. Morak en 1936 montre que la fixation d'un colorant sur une Ig ne modifie pas ses propriétés Ac. Coons et Kaplan fixent un composé fluorescent (fluorochrome) sur une Ig sans en modifier les propriétés immunologiques et appliquent leur méthode dès 1942 pour localiser les pneumocoques dans les organes de la souris.
II-1.1.3.1./ Fluorescences et fluorochromes
Les fluorochromes sont des substances capables, quand elles reçoivent un rayonnement incident d'une certaine longueur d'onde, de réémettre lors de leur désexcitation électronique une radiation thermique (IR) et une radiation de longueur d'onde supérieure à la longueur d'onde du rayonnement d'excitation (figure IV 3).
Dans la pratique, on utilise des fluorochromes qui absorbent l'énergie des radiations émises par des lampes à vapeur de mercure ayant un rayonnement intense sur les longueurs d'ondes du visible et de l'ultraviolet, et qui re-émettent dans le visible à une longueur d'onde supérieure. Le résultat est un marquage lumineux sur un fond de préparation noir, ce qui augmente considérablement la sensibilité de la méthode.
Les fluorochromes les plus utilisés et la couleur de leur fluorescence sont :
-Isothiocyanate de fluorescéine = fluorescence verte
-phycoérythrine = fluorescence rouge.
-isothiocyanate de rhodamine, acide sulfonique de rhodamine et rouge Texas = fluorescence rouge-orangé,
-acide sulfonique du 1 diméthyl aminonaphtalène = fluorescence rouge.
Actuellement d'autres fluorochromes se développent.
II-1.1.3.2./ Méthode de marquage
Ces fluorochromes se couplent spontanément aux protéines à pH alcalin grâce à leur fonction isothiocyanate ou acide sulfonique.
La qualité du conjugué obtenu peut être appréciée par la détermination du rapport molaire F/P (fluorochrome/protéine) qui varie expérimentalement de 1 à 22. Les bons conjugués ont un rapport F/P compris entre 1,5 et 4. Pour un F/P < 1,5 la fluorescence est faible. Pour un F/P> 4 la fluorescence est trop importante ce qui entraîne un risque de fluorescence non spécifique.
II-1.1.4./ Autres marqueurs utilisés en immunologie ou dans les dosages immunologiques
II-1.1.4.1./ Marqueurs utilisés dans les immunodosages
- Les bactériophages, en particulier les coliphages, sont utilisés dans des réactions d'inhibition de la lyse bactérienne.
- Les radicaux libres : marquage par le radical nitreux. La fixation des Ac sur la protéine portant le radical nitreux ou l'haptène marqué se traduira par une diminution considérable de l'amplitude du spectre de résonance du spin électronique (figure IV-4).
II-1.1.4.2./ Marqueurs utilisés en immunocytologie
Les Ac marqués à l'or ou à la ferritine permettent de faire des études en immunomicroscopie électronique.

II-1.2./ Méthodes faisant appel à des Ac ou à des Ag marqués
II-1.2.1./ Immunodosages des Ag ou des Ac par des techniques en phase hétérogène
La phase est hétérogène parce qu'il faut isoler les complexes Ag-Ac formés des Ac ou Ag restés en solution.
II-1.2.1.1./ Tests compétitifs
Ces tests utilisent l'inhibition compétitive par un Ac non marqué (il s'agit souvent d'un Ac monoclonal ou d'un mélange d'Ac monoclonaux) de la liaison entre un Ac marqué à un Ag correspondant. Le test que nous décrirons est appliqué au dosage de l'Ac mais peut être adapté à celui de l'Ag. L'Ac non marqué (Aco) et l'Ac marqué (Ac*) se fixent à l'Ag dans les proportions de leur mélange. La quantité du complexe Ac*-Ag diminue au fur et à mesure qu'augmente la quantité d'Aco dans le milieu.
Une courbe étalon établie avec des quantités connues et croissantes d'Aco pour une même quantité connue et constante d'Ac*, permet par simple report de connaître une quantité inconnue d'Aco contenue dans un liquide biologique (figures IV-5 et IV-6).
La mesure de la radio-activité du complexe Ac*-Ag ne peut être faite qu'après élimination de la fraction Ac* libre. Les méthodes pour séparer le constituant libre et le constituant lié dans le complexe Ag-Ac sont nombreuses et font appel à différentes techniques :
-Ultracentrifugation,
-Migration dans un champ électrique : électrophorèses sur papier, sur acétate de cellulose, en gel de polyacrylamide,
-Dialyse pour les haptènes de petit poids moléculaire,
-Adsorption de l'Ag libre sur un support solide : silicates (kaolin, talc), dextran, charbon de bois, cellulose, résines échangeuses d'ions,
-Précipitations :
* soit immunologique (méthode du double Ac) : le complexe Ag-Ac est précipité par un sérum anti-gammaglobuline;
* soit physico-chimique : par les solvants organiques (alcools...), le sulfate d'ammonium à demi-saturation (Test de Farr), la protéine A du staphylocoque;
* soit fixation de l'Ag sur un support solide : c'est la méthode la plus développée actuellement de par sa simplicité et sa rapidité de mise en oeuvre.
Les dosages immunologiques par compétition sont réalisés principalement avec les isotopes radioactifs et les enzymes comme marqueurs.
II-1.2.1.2./ Tests non compétitifs
Dans ces tests, l'Ag (ou l'Ac) est fixé à un support solide (billes, tubes, plaques pour microtitration en polystyrène, verre, etc..., ou bandelettes de nitrocellulose le plus souvent, mais des membranes de polyvinylidène difluoride ou de nylon peuvent aussi être utilisées). Dans le premier temps de la réaction, le liquide biologique à tester, contenant les Ac (ou les Ag), est mis en contact avec le support "sensibilisé" qui est ensuite lavé. Dans un deuxième temps, les Ac (ou les Ag) qui se sont fixés, sont révélés par l'addition d'un second Ac marqué : soit par un isotope radioactif pour les radio-immuno-assays (RIA), soit par une enzyme pour l'enzyme linked immuno sorbent assay (ELISA) ou pour l'immunoblot, soit par un fluorochrome pour la fluorimétrie. Après lavage, l'activité résiduelle est mesurée par un système adéquat spécifique du marqueur (compteur de désintégration, substrat de l'enzyme et spectrophotomètre, fluorimètre...) (figure IV 7a).
Pour l'immunoblot, dans un premier temps, un mélange complexe d'Ag (par exemple extrait nucléaire) est séparé par électrophorèse en dodécyl sulfate de sodium sur gel de polyacrylamide, en ses différents constituants selon leur Mr. Ces molécules sont ensuite électrotransférées sur une feuille de nitrocellulose qui découpée en bandelettes sera incubée avec le liquide contenant les Ac. Enfin la réaction Ag/Ac est révélée, le plus souvent, par un conjugué marqué par une enzyme (réaction colorée), par l'or (réaction colorée) ou radioactif (autoradiographie) (figure IV-7b). Les principes des différentes étapes permettant la réalisation d'immunoblots sont détaillés ci-dessous :

-a- Electrophorèse monodimensionnelle en présence de dodécyl sulfate de sodium (SDS)
L'électrophorèse permet de séparer un mélange protéique par la migration de ces constituants sous l'effet d'un champ électrique. Effectuée sur un support en gel de polyacrylamide et en présence de dodécyl sulfate de sodium, elle sépare les protéines en fonction de leur poids moléculaire.
* Gel de polyacrylamide
Un gel de polyacrylamide s'obtient par polymérisation de monomères d'acrylamide (CH2=CH-CO-NH2) et de son comonomère N, N' méthylène bisacrylamide (CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2). La formation de polymères est due à l'ouverture des doubles liaisons des monomères d'acrylamide. Cette polymérisation est initiée chimiquement par le persulfate d'ammonium combiné au N-N-N'-N'-tétra-méthylène-diamine (TEMED). Ce dernier catalyse la formation de radicaux libres sur le persulfate qui, sous cette forme, initie la polymérisation. La concentration en acrylamide détermine la longueur moyenne des chaînes, et la teneur en bisacrylamide le degré de réticulation. Un gel se définit par ces 2 paramètres:
- T = quantité totale d'acrylamide et de bisacrylamide pour 100ml de solution
- C = proportion relative de bisacrylamide par rapport à T
Ces valeurs permettent de contrôler la porosité des gels. Plus T est élevé, moins la porosité est importante et plus le gel aura un effet filtrant sur les protéines qui le traversent.
Il existe deux types de gels. Les gels à concentration constante en polyacrylamide et les gels à concentration variable, continu d'une extrémité à l'autre (gradient). Ces gels sont inertes chimiquement et électriquement, transparents, plastiques et présentent un courant d'électro-endosmose très faible.
* Migration sur système multiphasique
Ce système utilise l'effet combiné d'un système discontinu de tampons (de force ionique et de nature d'ions différents) et de deux gels superposés, l'un de faible concentration en polyacrylamide où commencent à migrer les protéines et où elles se concentrent, et l'autre de forte concentration où elles vont se séparer.
* Préparation des échantillons
Le but de ce type d'électrophorèse est d'obtenir une séparation des protéines selon leur Mr. L'encombrement stérique à l'origine de l'effet filtrant est fonction du Mr et de la forme de la molécule. Par l'intermédiaire d'un détergent anionique, le dodécyl sulfate de sodium (SDS), on supprime l'effet de la charge et de la forme de la protéine. En effet, par sa très forte affinité pour les protéines où il se lie par liaisons hydrophobes, le SDS va conférer une charge électrique constante, largement supérieure à la charge intrinsèque de la protéine. Toutes les protéines vont donc apparaître identiquement chargées. De plus, par son effet détergent, le SDS dénature les protéines qui vont prendre une forme en bâtonnet, en faisant disparaître leur configuration spatiale. Du SDS est également ajouté dans le tampon du gel afin de maintenir ces modifications lors de la migration. La dénaturation est complétée par le chauffage à 100C de la solution de l'échantillon. Outre le SDS, cette solution comporte du 2-mercapto-éthanol (ME) et du glycérol. Le ME dissocie les ponts disulfures en réduisant les liaisons disulfures. Les sous-unités reliées par ce type de liaison migreront indépendamment les unes des autres. La comparaison de migrations effectuées avec ou sans traitement au ME permet de savoir si une protéine est composée de sous-unités reliées par des ponts disulfures. Le glycérol confère à la solution d'échantillon une forte densité, la mettant en contact avec le gel et lui permettant de ne pas se diluer dans le tampon lors du dépôt. De la pyronine est ajoutée comme marqueur du front de la migration.
* Détermination du Mr après SDS-PAGE
Il existe une relation directe entre leMr et la mobilité d'une protéine. Le logarithme de son Mr est proportionnel à sa mobilité relative, c'est à dire au rapport, entre la distance de sa migration à la distance de migration d'un marqueur du front de migration, comme la pyronine. Mais l'étendue de la linéarité dépend de la concentration T du gel. A l'aide de protéines standards, une courbe d'étalonnage est établie. La précision de cette méthode est de l'ordre de 10%.
* Coloration des gels
Les protéines sont fixées dans le gel par de l'acide acétique. La forme anionique des molécules de colorant réagirait par liaisons électrostatiques avec les protéines, mais aussi par des forces de Van der Waals et interactions hydrophobes. Le colorant se fixe surtout sur les résidus arginine, mais aussi histidine, lysine, tyrosine, tryptophane et phénylalanine. Le nombre de molécules de colorants fixées à chaque molécule de protéine est proportionnel au nombre de charges positives de la protéine.
-b- Electrotransfert
La technique du transfert électrophorétique des protéines a été introduite pour la première fois par TOWBIN. Les protéines séparées par électrophorèse sont transférées sur une membrane par l'intermédiaire d'un courant électrique. Les protéines se fixent par liaisons hydrophobes et électrostatiques sur une membrane en nitrocellulose et uniquement par liaisons électrostatiques s'il s'agit d'une membrane nylon. Sur cette membrane, les antigènes peuvent être révélés par les anticorps contenus dans les sérums par des techniques radio-immunométriques ou immuno-enzymatiques. La combinaison du pouvoir de séparation de l'électrophorèse et la grande sensibilité de l'immunodétection fournissent un outil performant pour l'étude du couple antigène-anticorps.
-c- Immunoblot
L'immunoblot permet la détection immunologique, immuno-radiométrique ou immuno-enzymatique des protéines transférées sur une membrane. Les sites membranaires non occupés par des protéines sont bloqués par la fixation de lait écrémé en poudre, délipidé. L'utilisation d'un détergent, le Tween 20 concourt au blocage des sites d'absorption libres sur la feuille. La détection des anticorps fixés est réalisée par un anticorps conjugué à la peroxydase ou à l'or.

L'immunodot est une variante de l'immunoblot. L'électrophorèse est remplacée par une adsorbtion des Ag ou Ac sur une membrane de nitrocellulose (ou autres) sous forme de spots. Ensuite, l'immunodétection s'effectue selon le même protocole que celui utilisé pour l'immunoblot.
La radio-immunoprécipitation fait appel à des Ag marqués par un radio-isotope présents dans un mélange complexe de molécules que l'on met en contact avec le serum à tester. Les Ig sont alors précipitées à l'aide d'Ac anti-Ig, puis une électrophorèse en SDS-PAGE est effectuée avec le précipité. Si ce dernier contient l'Ag (donc si l'Ac se trouvait dans le sérum), une autoradiographie le révèle. Cette méthode est surtout employée pour identifier un Ag reconnu par un Ac déterminé.
II-1.2.2/ Méthodes immunohistologiques ou immunocytologiques
Ces méthodes consistent à étudier les Ag (ou les Ac) présents sur ou dans une cellule, dans un tissu ou une culture cellulaire par la liaison des Ac (ou des Ag) correspondants préalablement marqués.
Les marqueurs utilisés sont :
* Les enzymes et principalement la peroxydase (microscopies optique et électronique).
* Les fluorochromes (microscopie optique à fluorescence)
* Les isotopes radioactifs (microscopies électronique et optique : révélation par autoradiographie).
* Le fer (microscopie électronique : ferritine).
* Les particules d'or (microscopies optique et électronique).
On peut utiliser ces marqueurs dans plusieurs types de techniques : réation directe, réaction indirecte, réaction en sandwich et méthode utilisant des Ac anticomplément (figure IV-7c).
Les réactions d'immunofluorescence et d'immunoperoxydase indirectes (IFI et IPI) se prêtent bien à une estimation de la concentration des Ac (ou des Ag) présents dans un liquide biologique mis en contact au cours du premier temps de la réaction, pour cela il suffit de déterminer la dilution la plus élevée qui permet d'obtenir encore une activité peroxydasique ou une fluorescence positive. Cette concentration est exprimée de façon semi-quantitative par le titre en Ac qui est l'inverse de la dilution limite. Ex : si la dilution limite est la dilution au 1/4096 du sérum dans un tampon approprié le sérum sera dit "positif avec un titre de 4096". Ce sont des réactions très utilisées pour détecter les auto-anticorps et apprécier leur concentration.

II-2. Réactions secondaires

II-2.1./ Immunodosages des Ag ou des Ac par des techniques en phase homogène
Dans ces tests l'Ac en se fixant sur l'Ag (le plus souvent un haptène) modifie de façon sensible l'activité du traceur. La variation de celle-ci révèle ainsi la fixation de l'Ac sur l'haptène. L'Ac intervient comme effecteur sur la réaction de révélation du marqueur ce qui supprime l'étape intermédiaire de séparation.
Les principaux marqueurs utilisés sont décrits ci-dessous.
II-2.1.1./ Les radicaux avec électron impair
La fixation de l'Ac sur l'haptène marqué par exemple par le radical nitreux, se traduit par une stabilisation du spin de l'électron (figure IV-4).
II-2.1.2./ Les enzymes (le lysozyme, la G6PD, la malate déshydrogénase...)
Dans un premier groupe de dosages, les Ac inhibent l'activité de l'enzyme, soit en empêchant l'accès du substrat au site actif de l'enzyme, soit en déformant le site actif ce qui le rend inopérant.
Dans un second groupe de dosages soit les molécules de l'échantillon à tester déplacent les molécules marquées de leur site de fixation sur l'Ac libérant ainsi l'activité enzymatique qui peut alors être révélée par le substrat approprié, soit la fixation de l'Ac sur l'haptène marqué par une enzyme lève l'inhibition exercée par l'haptène sur l'enzyme.
II-2.1.3./ La réaction d'extinction de la fluorescence (fluorescence quenching)
Les protéines telles que les Ig excitées par une énergie lumineuse de longueur d'onde 290 nm (ultraviolet) émettent une énergie lumineuse à 345 nm. L'interaction des Ac avec un haptène modifie ce phénomène, soit en supprimant la fluorescence, soit en la décalant vers une autre longueur d'onde. En pratique, la mesure se fait en présence de quantités variables d'haptènes.

II-2.2./ Dosage immunologique en couche mince (thin layer immunoassay)
Le fond des boîtes de Pétri en polystyrène est recouvert par adsorption d'une couche de molécules de capture (Ag ou Ac), puis d'une couche mince de gélose. Dans cette dernière sont creusées des cupules remplies soit de l'Ac, soit de l'Ag. Dans le cas où des Ac sont introduits dans les cupules, on y rajoute en général un sérum anti-Ig. Après élimination de la gélose, les boîtes sont renversées pendant 1 minute au-dessus d'un récipient d'eau à 56°C. Comme les complexes immuns sont hydrophiles, à l'endroit où ils se trouvent une zone de condensation en grosses gouttelettes se forme permettant de les localiser. Cette zone est d'autant plus large qu'il y a plus d'Ac (ou d'Ag). Cette méthode a été appliquée au diagnostic sérologique des infections herpétiques.

II-2.3./ Immunoprécipitation
Elle fait intervenir des Ag et des Ac en solution. Les Ag porteurs de plusieurs sites antigéniques mélangés aux Ac correspondants ayant au moins 2 sites Ac (les Fab ne sont jamais précipitants) peuvent former un réseau tridimensionnel qui précipite. La quantité de précipité varie avec les proportions relatives des réactifs. En excès d'Ag, il n'y a pas de précipité, le CI est soluble. Dans certains systèmes (Ag présentant peu de déterminants antigéniques, sérum humain ou de cheval), il y a également absence de précipitation en excès d'Ac, bien qu'en règle générale les CI en excès d'Ac soient précipitants.
Dans des conditions expérimentales particulières, il n'y a pas de précipitation bien que l'Ag et l'Ac soient multivalents. Il peut s'agir soit d'Ac de faible avidité dont les deux sites Ac (ou plus) ne sont pas fixés en même temps sur des molécules d'Ag différentes (le réseau est alors instable), soit au contraire d'Ac de forte avidité dont les deux sites Ac (ou plus) sont fixés sur 2 sites antigéniques voisins de la même molécule d'Ag : liaison monogame (la formation du réseau est alors impossible) (figure IV-8).
Deux méthodes sont pratiquées pour détecter les Ac précipitants : l'immunoprécipitation en milieu liquide et l'immunoprécipitation en gel.
II-2.3.1./ Immunoprécipitation en milieu liquide - Néphélométrie ou turbidimétrie
On mélange dans des tubes à hémolyse les solutions d'Ag et d'Ac dans des proportions variables pour avoir, au moins, dans quelques tubes les conditions de formation du réseau et une précipitation. La quantité de précipité peut être appréciée de façon pondérale, ou par le contenu en azote (méthode de Heidelberger et Kendall), ou par la quantité d'Ag (ou d'Ac) marqué ou repérable par une propriété propre à l'Ag (figure IV-9).
La méthode néphélométrique permet de détecter facilement la formation de CI insolubles car ceux-ci provoquent une augmentation de la turbidité du milieu réactionnel que l'on peut mesurer par le néphélomètre à rayon Laser. La lumière est d'autant plus diffractée que le précipité est dense (méthode très sensible et très reproductible). On travaille habituellement en excès d'Ac.
Une variante de la précipitation en milieu liquide est représentée par le test de l'anneau où l'on introduit dans un tube étroit d'abord une solution d'Ac (ou d'Ag) puis, par-dessus, et sans mélanger une solution d'Ag (ou d'Ac) (figure IV-10).
II-2.3.2./ Immunoprécipitation en milieu gélifié
C'est une technique où Ac et Ag diffusent dans le milieu gélifié.
La précipitation est obtenue dans la région du gel où Ag/Ac se trouvent dans des proportions permettant la formation du réseau.
II-2.3.2.1./ Technique historique d'immunodiffusion en tube de Oudin
Elle n'est pratiquement plus utilisée. Elle consiste à couler dans un tube une solution d'agar en surfusion (45C) contenant un antisérum et de déposer sur l'agar après gélification une solution d'Ag qui diffusera dans le gel formant un gradient de concentration. La précipitation a lieu au niveau du front de diffusion (figure IV-11) à l'endroit où les concentrations en Ag et Ac correspondent à la zone d'équivalence.
II-2.3.2.2./ Immunodiffusion (ou double diffusion) en plaque d'Ouchterlony
L'agar est coulé soit en boîte de Pétri, soit sur lames de verre et ne contient initialement ni Ag ni Ac.
Dans un deuxième temps, des puits creusés dans le gel servent de réservoirs les uns pour des solutions d'Ag et les autres pour des sérums immuns. A partir de ces réservoirs, les réactifs diffusent l'un vers l'autre librement dans le gel et la précipitation a lieu au niveau de la zone d'équivalence (figure IV-12). Outre sa simplicité, cette technique a l'avantage de permettre de comparer le comportement de plusieurs immuns sérums vis-à-vis d'un Ag et inversement. C'est ainsi qu'ont pu être définies entre 2 Ag (ou plus) des réactions d'identité, d'identité partielle, et de non identité (figure IV-13). La réaction de semi-identité se traduit par la formation d'un éperon en immunodiffusion radiale et correspond à la situation où les 2 Ag, bien que différents, possèdent en commun un même déterminant (1) et au moins un épitope différent (2 ou 3). L'Ag (1-2) est précipite par les Ac (1). Les Ac (2) diffusent pour leur propre compte, croisent la ligne de précipitation et réagissent avec le déterminant (2) de l'Ag (1-2). La concavité de l'arc de précipitation est dirigé vers le réactif qui a le Mr le plus grand et qui par conséquent diffuse le moins facilement dans le gel.
II-2.3.2.3./ Immunodiffusion radiale simple de Mancini
C'est l'équivalent sur plaque de l'immunodiffusion en tube de Oudin. L'antisérum est préalablement incorporé au gel en surfusion et coulé en boîte de Pétri ou sur une plaque de verre. Après refroidissement, des puits sont creusés dans le gel. Dans chaque puits est déposée, sous un volume constant, une des dilutions successives d'un Ag. L'Ag diffuse et précipite au niveau des zones d'équivalence avec l'antisérum contenu dans le gel sous la forme d'un cercle opaque dont le diamètre est proportionnel à la concentration d'Ag déposée dans le puits correspondant (figure IV-14).
L'établissement d'une courbe étalon (figure IV-15) à partir de solutions contenant des concentrations connues et croissantes d'Ag permet de préciser la concentration d'une solution inconnue du même Ag par la simple mesure du diamètre du cercle de précipitation. Cette méthode est éventuellement applicable aux Ac.
II-2.3.2.4./ Immunoélectrophorèse (figure IV-16).
-a- Immunoélectrophorèse type
Dans un premier temps, les molécules antigéniques sont séparées grâce à leur différence de mobilité dans un champ électrique. Dans un deuxième temps, lorsque la séparation est jugée suffisante, un antisérum est placé dans une rigole parallèle au sens de migration des Ag. Ag et Ac diffusent librement dans le gel et donnent des arcs de précipitation selon le même principe que l'immunodiffusion d'Ouchterlony. Cette technique est hautement discriminative et a permis la mise en évidence de plus de 30 molécules antigéniques différentes dans le sérum humain en utilisant comme Ac un sérum animal antisérum humain. Par ailleurs, elle se prête à une étude semi-quantitative des concentrations d'Ag et permet de préciser la classe et la sous-classe des Ig monoclonales.
-b- Variantes de l'immunoélectrophorèse
L'immunoélectrophorèse telle qu'elle vient d'être décrite est la technique initiale de Grabar et Williams. Il en existe deux variantes proposées par Laurell.
* Electrophorèse croisée : Le premier temps est une électrophorèse de la solution d'Ag. Puis la bande de gel qui contient les différentes fractions antigéniques séparées, est découpée et placée sur une plaque de gel qui contient l'antisérum. Un nouveau champ électrique est appliqué perpendiculairement à la bande découpée. Les Ag migrent de la bande dans la nouvelle plaque contenant l'antisérum et font apparaître une zone de précipitation au niveau des zones d'équivalence. L'allongement de l'arc de précipitation est fonction de la quantité d'Ag (figure IV-17)
* Electrophorèse en rocket : Elle est à l'immunoélectrophorèse ce que l'immunodiffusion simple radiale de Mancini est à l'immunodiffusion simple d'Ouchterlony. Dans un gel coulé en plaque, contenant un antisérum spécifique, des puits sont creusés pour y placer soit des concentrations connues d'un Ag qui permettront d'établir une courbe étalon, soit des concentrations inconnues qui pourront être alors déterminées. La migration de l'Ag est assurée par un champ électrique (figure IV-18). Au niveau des zones d'équivalence entre Ag et Ac, une zone de précipitation se forme. Elle est d'autant plus allongée que la concentration de la solution d'Ag déposée dans le puits est plus grande. Cette méthode sensible permet de pratiquer des dosages d'Ag.
II-2.3.2.5./ Contre-immunoélectrophorèse ou électrocinérèse.
Dans certains systèmes et en choisissant judicieusement les conditions physico-chimiques de la migration dans un champ électrique, il est possible de faire migrer l'Ag dans un sens et les Ac de l'immunsérum dans le sens opposé. Ag et Ac migrent alors rapidement à la rencontre l'un de l'autre. Au niveau des zones d'équivalence, la réaction Ag-Ac conduit à la formation d'un arc de précipitation. Cette technique a été proposée au début pour la détection de l'Ag associé à l'hépatite B (Ag HBs) ou celle des Ac correspondants, ainsi que pour la mise en évidence d'auto-Ac spécifiques de différents Ag solubles du noyau.

II-2.4./ Agglutination et hémagglutination (figure IV-19)
Elles font intervenir des Ag (plus rarement des Ac) portés par un élément figuré. Les Ag peuvent exister spontanément sur la cellule (Ag de groupes érythrocytaires sur les hématies, Ag bactériens sur les bactéries,...) ou être fixés artificiellement sur une particule inerte (latex, gélatine, bentonite, cholestérol, or colloïdale) ou une cellule grâce à un agent de couplage. On parle alors d'agglutination conditionnée ou passive. Pour les particules d'or, lors de l''agglutination, la lumière qui n'est pas absorbée, peut être réfractée. Par agrégation, ces particules forment de gros amas qui ne présentent pas vis-à-vis de la lumière les mêmes propriétés et la solution devient incolore. Le principe est adapté aux dosages immunochimiques en fixant des Ac (ou des Ag) sur ces particules d'or. L'addition de l'Ag (ou de l'Ac) entraîne l'agrégation des particules donc la décoloration de la solution colloïdale.
Une variante de l'agglutination ou de l'hémagglutination est représentée par la réaction d'inhibition de l'agglutination ou de l'hémagglutination par l'Ag soluble. Dans un premier temps, l'antisérum (ou l'Ac) est mis en contact avec une solution de l'Ag correspondant. Dans un deuxième temps, les particules ou les hématies porteuses de ces Ag sont ajoutées. Les Ac entraînent alors l'agglutination si leurs sites Ac n'ont pas été utilisés par l'Ag soluble au cours du premier temps de la réaction. En revanche, l'absence d'Ag lors du premier temps permet l'agglutination par les Ac au cours du deuxième temps. Cette réaction d'inhibition par l'Ag soluble est notamment mise en oeuvre pour le dosage de l'hormone gonadotrope chorionique urinaire (HCG) dans le diagnostic immunologique de la grossesse.
La concentration des Ac agglutinants d'un sérum s'exprime par le titre du sérum. Le titre n'est qu'une estimation semi-quantitative puisque la quantité pondérale des Ac n'est pas seule en cause. L'avidité des Ac, la présentation et la quantité des Ag situés sur les particules ou les hématies interviennent également.
Les réactions d'hémagglutination ou d'inhibition de l'hémagglutination telles qu'elles viennent d'être décrites, font intervenir des Ag fixés sur des hématies. Il ne faut pas les confondre avec la réaction d'inhibition de l'hémagglutination virale qui met en jeu, dans un premier temps un virus et des Ac antivirus dirigés contre l'hémagglutinine du virus, et dans un deuxième temps des hématies qui portent des récepteurs pour cette hémagglutinine. Dans cette réaction, les Ac antiviraux protecteurs se fixent sur le virus et empêchent sa combinaison avec les récepteurs des hématies introduites dans le deuxième temps de la réaction. Si la réaction d'hémagglutination virale se produit, c'est que le sérum testé au cours du premier temps ne contenait pas d'Ac antivirus. Les hématies sont alors des GR de poussin qui possèdent naturellement et fortuitement des récepteurs pour le virus grippal. Cette réaction d'inhibition de l'hémagglutination virale est en fait une réaction de neutralisation.

II-2.5./ Réactions de neutralisation
La fixation des Ac spécifiques sur les sites antigéniques de certaines molécules peut inhiber leur fonction biologique. Comme l'illustrent les exemples suivants : Ac inhibant l'hémagglutination virale, Ac spécifiques neutralisant l'activité toxique d'une toxine d'où un effet protecteur et Ac anti-tétaniques. Cette propriété peut également être utilisée pour typer les toxines en neutralisant par des sérums monospécifiques leurs effets toxiques sur l'animal sensible.
La neutralisation de l'activité des enzymes est un test courant en sérologie bactérienne. La recherche et le titrage des Ac anti-streptolysine, streptokinase ou streptodornase par ce procédé, permet de porter le diagnostic d'infections récentes ou itératives à streptocoques.

II-2.6./ Réaction de fixation du C par les Ac ayant réagi avec les Ag correspondants
Ces Ac fixant le C sont chez l'homme les IgG1, G2, G3 et les IgM.
II-2.6.1./ Réaction faisant intervenir toutes les fractions du C (de C1 à C9)
II-2.6.1.1./ Réaction de fixation du C hémolytique
Elle se déroule en quatre temps :
* 1er temps : chauffage 30 mn à 56°C pour détruire le C du sérum à tester.
* 2ème temps : mise en contact du sérum avec l'Ag
* 3ème temps : addition de C en quantité connue.
* 4ème temps : addition de globules rouges de mouton (GRM) et d'Ac anti-GRM.
Si le sérum ne contient pas d'Ac, il n'y a pas formation de complexes Ag-Ac au cours du 2ème temps, le C ajouté au 3ème temps n'est pas utilisé et reste disponible pour intervenir au 4ème temps et conduire à la lyse de GRM recouverts d'Ac anti-GRM. Ceci se traduit par la présence d'hémoglobine dans le surnageant. Inversement, la présence d'Ac dans le sérum entraîne la formation de CI au 2ème temps qui consommeront le C au 3ème temps. Le 4ème temps se déroule alors en l'absence de C, donc la lyse des GRM par les Ac anti-GRM n'aura pas lieu.
II-2.6.1.2./ Réaction de lyse des liposomes
On peut faire appel à la place des GRM à des liposomes analogues structuraux artificiels de la membrane cytoplasmique. Il s'agit de sphères formées par une membrane artificielle constituée de lécithine, de cholestérol et de phospholipides. Des Ag solubles sont introduits dans cette membrane et s'expriment à sa surface. Un marqueur, par exemple du galactose en solution, est piégé à l'intérieur de la sphère. La fixation des Ac, puis du C sur la membrane synthétique, produit des pores par lesquels le galactose du liposome s'échappe. Il suffit alors de le doser pour apprécier l'intensité de la réaction.
II-2.6.1.3./ Réaction de cytolyse par le C
La fixation du C par des Ac fixés sur des Ag portés par une cellule vivante provoque la lyse de la cellule ou tout au moins des lésions de sa membrane (figure IV-20).
Lorsqu'il s'agit d'hématies, les lésions sont objectivées par la libération d'hémoglobine dans le milieu.
Lorsqu'il s'agit de cellules nucléées, ces lésions s'accompagnent d'anomalies variées. Dans le cas des toxoplasmes (test de Sabin et Feldman), ces parasites n'excluent plus un colorant vital (bleu Trypan), aussi les cellules lésées se colorent-elles en bleu alors que les toxoplasmes intacts restent incolores. Pour le sérodiagnostic de la syphilis, la fixation des Ac, puis du C, sur des tréponèmes vivants inhibe leur mobilité. Les tréponèmes intacts restent mobiles, ceux qui ont été lésés, restent immobiles (test de Nelson ou test d'immobilisation des tréponèmes).
Le système peut être généralisé à toutes les cellules qu'il suffit de marquer au 51Cr. La fixation des Ac et du C altère les cellules qui relarguent alors du 51Cr dans le surnageant de culture. Pour apprécier la cytolyse, il suffit de compter la radioactivité du surnageant.
II-2.6.2./ Réactions faisant intervenir certaines fractions du C
II-2.6.2.1./ Immunoadhérence (hématies et plaquettes de primates) et opsonisation (phagocytes)
Ce sont des réactions qui font intervenir des cellules (hématies et plaquettes humaines ou de singe, leucocytes) ayant un récepteur pour le C3. Des Ag particulaires (bactéries, virus...), après liaisons avec leurs Ac, activent le C jusqu'à C3, et grâce à ce dernier se fixent sur les cellules précédentes.
De telles réactions servent in vitro pour révéler la réaction Ag-Ac-C, mais elles jouent aussi in vivo un rôle physiologique dans la défense contre les agents infectieux puisqu'elle favorise la phagocytose.
II-2.6.2.2./ Réaction de fixation du C1q marqué
Le sérum à étudier est incubé avec du C1q marqué par un isotope radioactif. Dans un deuxième temps le C1q libre et le C1q lié aux complexes Ag-Ac, sont séparés par précipitation différencielle à l'aide de polyéthylèneglycol. La mesure de la radioactivité de la fraction contenant les CI permet de les doser.
Cette méthode est plus particulièrement appliquée pour la mise en évidence de CI circulants préformés dans le sérum de malades.

III- SENSIBILITE COMPAREE DES DIFFERENTES METHODES

Elle est indiquée dans le tableau ci-dessous :
* Concentrations minimales d'anticorps détectables

Tests	Ac µg/ml
Précipitation en milieu liquide	0,5-125
Précipitation en milieu gélifié *diffusion double (Ouchterlony)	3-20
Précipitation en milieu gélifié*diffusion radiale (Mancini)	3-10
Précipitation en milieu gélifié*immunoélectrophorèse	50-200
Agglutination bactérienne	0,01-0,1
Hémagglutination directe	0,03-0,5
Hémagglutination passive	0,001-0,03
Hémolyse	1
Fixation du complément	0,1-1
Immunofluorescence	0,1
Dosages radio-immunologiques ou immunoenzymatiques	0,00001 à 0,001

* Concentrations minimales d'Ag détectables pour 1 Ag de 50 kDa

Tests	Ag mg/ml
Précipitation en milieu gélifié*diffusion double (Ouchterlony)	1-10
Précipitation en milieu gélifié*électrocinérèse	0,3-1
Précipitation en milieu gélifié*immunoélectrophorèse	10
Hémagglutination passive	0,001-0,005
Dosages radio-immunologiques et enzymo-immunologiques	0,0001-0,001