XI-PHENOMENES BIOCHIMIQUES INTERVENANT DANS L'APOPTOSE

La mort des cellules, qui ne résulte pas d'une atteinte accidentelle de la cellule (comme dans la nécrose), est le plus souvent une mort cellulaire programmée ou apoptose, véritable "suicide" cellulaire. En 1972 , le terme d'apoptose a été proposé par Kerr, Wyllie et Currie. Il provient d'un mot grec qui signifie : chute des pétales d'une fleur ou des feuilles d'un arbre. Ellis et Horvitz en 1986 démontrèrent chez le nématode Caenorhabditis elegans l'existence de gènes inhibiteurs et inducteurs de l'apoptose, dont des équivalents ont ensuite été mis en évidence chez les mammifères.
Tout d'abord phénomène physiologique régulateur équilibrant le nombre des cellules d'un tissu normal, c'est aussi un processus qui peut être pathologique. En immunologie, l'apoptose intervient, d'une part dans l'élimination des B et T inadaptés ou dangereux (auto-agressifs), d'autre part dans la destruction des cibles cellulaires par les cellules de l'immunité à activité cytotoxiques.

XI-1/ Caractères morphologiques et biochimiques de l'apoptose

XI-1.1/ Les modifications morphologiques (Figure VI-58)

Elles sont nombreuses et se situent aussi bien au niveau de la membrane, que du cytoplasme et du noyau, mais sont seulement visibles convenablemnt en microscopie électronique.
L'apoptose concerne généralement quelques cellules isolées (à la différence de la nécrose qui porte sur un ensemble de cellules voisines).
Les modifications morphologiques nucléaires et cytoplasmiques au cours de l'apoptose sont les suivantes :
* En tout début, les cellules s'isolent, perdent les jonctions cellulaires (destruction des desmosomes) et leurs expansions cytoplasmiques si elles en ont. Donc, on assiste au lissage de la surface de la cellule.
* Puis la cellule se rétracte et on observe une diminution du volume cellulaire et un regropement des organites cellulaires qui cependant restent en apparence intacts (contrairement à la nécrose). Ainsi, les organites cellulaires, comme les mitochondries peuvent migrer à un pôle du cytoplasme.
* La membrane cellulaire bien que conservant son intégrité et restant imperméable aux colorants vitaux, prend un aspect frippé et ainsi la cellule à une surface convolutée.
* Ensuite il y a condensation de la chromatine en mottes qui s'accolent ensuite le long de l'enveloppe nucléaire formant un croissant homogène marginal dense. Le nucléole se désintègre. Puis le noyau prend un aspect très dense homogène (aspect pycnotique) et se fragmente parfois. L'enveloppe nucléaire disparaît et le cytoplasme se divise alors en fragments contenant des morceaux du noyau et des organites cellulaires apparemment intacts, ces fragments formant ainsi les corps apoptotiques de taille optimale pour être phagocytés par les cellules environnantes. Cette élimination se fait très rapidement et n'est donc pas facilement observée.
Comme ce processus naturel d'apoptose n'est généralement pas massif, touchant quelques cellules progressivement, on utilise pour l'étudier, des agents inducteurs d'apoptose (comme les glucocorticoides sur les thymocytes) provoquant une apoptose plus importante. La dégradation des corps apoptotiques survient après phagocytose par des macrophages. Les granulocytes neutrophiles n'interviennent pas. L'apoptose n'induit pas de réaction inflammatoire. En effet, la dégradation des corps apoptotiques se fait dans le cytoplasme des macrophages. A la différence de la nécrose, leur contenu de la cellule n'est pas déversé dans le milieu. Il n'y a donc pas d'activation des protéases qui déclenchent la réponse inflammatoire.

XI-1.2/ Les modifications biochimiques

Ces modifications morphologiques, principalement visibles en microscopie électronique, sont l'expression d'événements moléculaires au sein ou à la surface de la cellules :
* fragmentation de l'ADN par des endonucléase
* augmentation du taux de Ca ++ cytosolique
* expression de c-myc
* expression de bcl-2
* expression de p53
* signalisation par fas/APO-1 après association à son ligand fas L
* intervention d'enzymes comme : kinases, famille ICE, ...
* exposition des phosphatidyl-sérines en surface
-etc...

-a-Modifications cytoplasmiques

L'augmentation de la concentration de Ca++ est rapide et prolongée. Elle apparaît dès les premiers événements qui accompagnent l'apoptose. Les ions calciques sont en partie extracellulaires puisqu'en milieu dépourvu de Ca++ les cellules ne présentent plus l'apoptose.
Les mitochondries, bien qu'ayant un aspect pratiquement normal, perdent leurs capacités fonctionnelles notamment le pouvoir de synthèse de l'ATP, car elles sont très précocement le siège d'une chute du potentiel transmembranaire (Dym) par ouverture des pores de transition de la perméabilité (Mitochondrial Permeability Transition pores (MTP) ou mégacanaux) de la membane interne de la mitochondrie. Il en résulte une augmentation de la perméabilité aux molécules de Pm inférieur ou égal à 1500Da, alors que dans les conditions normales la membrane interne de la mitochondrie est pratiquement imperméable aux petites protéines ce qui crée un gradient électrochimique. Les MTP jouent notamment un rôle déterminant dans l'induction de l'apoptose par les radicaux libres de l'oxygène (RLO). Ainsi, sous l'effet de stress oxydants, les mitochondries subissent une transition de perméabilité avec libération de Ca++, et sont le siège d'un gonflement important et d'un découplage de la respiration mitochondriale. Les MTP sont au niveau de la membrane interne des mitochondries des canaux sensibles à la ciclosporine qui, en se liant aux cyclophilines (famille de protéines ubiquitaires qui en sont la cible intracellulaire), a la capacité de fermer les MTP. L'HSP70 pourrait jouer un rôle similaire à celui des cyclophilines au niveau de la membrane externe de la mitochondrie. Il semble exister une coopération entre l'HSP7O au niveau de la membrane externe, et les cyclophilines au niveau de la membrane interne. Cette coopération impliquerait également Bcl-2, car l'effet anti-apoptotique de Bcl-2 est relayé par la fermeture des MTP.
L'HSP70 pourait également chaperonner spécifiquement les facteurs de mort mitochondriaux (apoptosis inducing factors) prévenant ainsi leur action proapoptotique. L'un de ces facteurs de mort serait le cytochrome c. Or, l'un des membres de la famille des HSP70 lie spécifiquement le cytochrome c.
L'activation des transglutaminases (enzymes cytoplasmiques calcium-dépendantes) entraîne la polymérisation des protéines (en formant des ponts entre les résidus glutamine et lysine) responsable en partie des modifications ultrastucturales du cytoplasme (agrégation des organites et densification) conduisant aux corps apoptotiques.

-b-Modifications nucléaires

La condensation de la chromatine, qui survient après l'atteinte des mitochondries, est en général suivie d'une dégradation de l'ADN donnant des fragments oligonucléosomaux le plus souvent multiples de 180-200 paires de bases. La migration électrophorétique de ces fragments en gel d'agarose donne un aspect en échelle (Figure VI-59). Ce clivage est obtenu par l'action d'une endonucléase endogène qui est Ca++ dépendante et/ou Ca++/Mg++ dépendante. D'autres nucléases sont aussi en cause dans une fragmentation de l'ADN plus grossière et qui interviendrait plus précocement dans le déroulement de l'apoptose. Dans la cellule à l'état normal, ces enzymes seraient inactives du fait de la présence sur elles de chaînes de poly ADP-ribose. Durant l'apoptose, ces oligomères sont écartés de l'enzyme et en même temps le taux de Ca++ augmente, alors l'endonucléase devient active et la fragmentation de l'ADN se produit.
La fragmentation internucléosomale ou non de l'ADN est due à l'activation d'endonucléases non lysosomales puisque ces organites restent intacts pendant l'apoptose.
Parfois l'apoptose ne s'accompagne pas de fragmentation internucléosomale de l'ADN nucléaire. D'autres critères sont alors à prendre en compte tels que la dégradation de l'ADN libérant des fragments de 50 à 300 kilobases ou les modifications fonctionnelles des mitochondries

-c-Modifications de la membrane plasmique

Plusieurs modifications de surface interviennent dans la phagocytose finale des cellules apoptotiques par les macrophages :
* perte en acide sialique,
* expression du récepteur de la vitronectine,
* transduction des phosphatidylsérines en surface de la membrane plasmique (Figure VI-60)

XI-2/ Contrôle de l'apoptose (Figure VI-61) .

Après des durées de vie variable (parfois très longues comme pour les neurones), toutes les cellules meurent. Cette mort est placée sous la dépendance de gènes spécifiques.
Une cellule qui ne reçoit plus de signaux de survie, s'engage dans la voie du suicide. Ces signaux peuvent être externes (hormone, facteurs de croissance...), mais aussi internes (expression de gènes de survie...)
La cellule peut aussi recevoir des signaux de suicide. Ces signaux peuvent être internes (expression des oncogènes, lésion du génome...), mais aussi externes (ligand de fas, TNF, granzymes...). Ainsi, le gène de fas/APO-1 code pour une glycoprotéine de surface (CD95) qui appartient à la famille du récepteur du TNF. Chez les mammifères, un grand nombre de tissus exprime fas à des degrés divers. Fas constitue une molécule cible pour le fasL des lymphocytes cytotoxiques. Sous l'effet de la liaison de fas avec son ligand, l'apoptose se déclenche.
Les souris lpr et gld, respectivement déficientes en fas et son ligand, développent des maladies auto-immunes. Fas et de son ligand participent donc aux processus d'élimination des lymphocytes autoréactifs.
D'autres récepteurs sont capables de transmettre un signal pro-apoptotique :
TNFR1, DR3, DR4 (TRAILR1 : TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptor 1), DR5 (TRAILR2), DR6 (Figure VI-62).
Ces récepteurs portent un domaine intracytoplasmique de mort. Dans des conditions particulières, le BcR et le TcR peuvent également induire l'apoptose.
Les études d'Ellis et Horvitz en 1986, sur Caenorhabditis elegans, sont les premiers travaux qui ont permis d'identifier plus d'une dizaine de gènes dont les produits contrôlent le processus apoptotique. Ces gènes ont été nommés ced (pour cell death). Parmi ceux-ci figurent notamment ced-3, ced-4, EGL1 et ced-9. Les 3 premiers sont des régulateurs positifs de l'apoptose alors que le dernier l'inhibe. Les analogues chez les mammifères sont :
* Famille (sérine-protéases) des caspases pour ced-3
* Apaf (Apoptosis-activating factor 1) pour ced-4
* BH3 (Bcl2-homology domain 3) pour EGL1
* Bcl-2 pour ced-9
Bcl2 inhibe le pro-apoptotique Apaf dont la fonction est d'activer les caspases pro-apoptiques. BH3 a une activité pro-apoptotique en inhibant bcl2 qui protège contre l'apoptose.
ced-3/caspases
Le gène ced-3 de Caenorhabditis elegans code pour une protéine appartenant à la famille des sérine protéases. La surexpression de ce gène dans des cellules de mammifères provoque leur apoptose.
Les effets apoptotiques de fas L et du TNF passent par une activité protéasique de la caspase 8, puis de la caspase 3 (Figure VI-61). Cette dernière est activée indépendamment de la mitochondrie dans les cellules de type I, en revanche son activation passe par la mitochondrie pour les cellules de type II.
Bcl-2 (Figure VI-63)
Le gène de bcl-2 a été identifié initialement comme un oncogène surexprimé, juxtaposé au locus des chaînes lourdes d'immunoglobulines à la suite d'une translocation, dans les lymphomes folliculaires à cellules B de l'homme.
Bcl-2 ne stimule pas la prolifération cellulaire, mais allonge la survie des cellules. Bcl-2 est ainsi appelé gène de survie. Les produits exprimés par le gène se localisent au niveau de la membrane externe des mitochondries, de l'enveloppe nucléaire et du réticulum endoplasmique. Dans des conditions d'expression normale, bcl-2 empêche les cellules de type II de se suicider.
Il inhibe l'apoptose induite par d'autres gènes.
De plus, bcl-2 n'est en fait que le premier représentant d'une famille dont les membres, pro- ou anti-apoptotiques, ont en commun une similarité de séquence à leur extrémité C-terminale. Cette famille compte plus de dix membres (bcl-xL, bcl-xS, bax, bad, bak ... ) dont les protéines sont susceptibles de s'assembler sous la forme d'hétérodimères. L'assemblage d'unités à effet pro et anti-apoptotiques dans ces hétérodimères module la capacité de réponse des cellules aux signaux de mort cellulaire, dans le sens de la survie ou de la mort. Ces membres de la famille bcl2, comme la bcl2, sont associés à la membrane interne des mitochondries.
Bcl-2 pourrait inhiber le transport de certaines cyclines et de p53 dans le noyau, moduler la distribution des ions Ca ++ et contrôler ainsi l'activité des endonucléases calcium-dépendantes.
C-myc
L'expression du proto-oncongène c-myc est liée au contrôle de la croissance cellulaire et de la prolifération en intervenant pour l'entrée de la cellule dans la phase S de synthèse du cycle cellulaire. Mais la surexpression de c-myc peut induire et accélérer l'apoptose de cellules en culture en l'absence de facteurs de croissance adéquats. Il stimule donc, selon les circonstances, la prolifération ou l'apoptose. La prolifération cellulaire peut entraîner l'insuffisance ou l'absence de facteurs de croissance et donc entraîner l'apoptose.
Chez des souris transgéniques exprimant très fortement c-myc, l'expression de bcl-2 dans des cellules pré-B allonge de manière très importante la survie des cellules. D'après certains auteurs, bcl-2 coopère avec c-myc pour conduire à l'immortalisation des cellules.
p53
Le gène p53 (oncosuppresseur) code pour une nucléophosphoprotéine activateur transcriptionnel des gènes jouant un rôle important dans la prolifération cellulaire, notamment comme inhibiteur du cycle cellulaire en phase Gl et comme inducteur de la différenciation cellulaire.
La protéine p53 a le surnom de gardien de l'intégrité du génome. En effet en présence d'altérations de l'ADN, cette protéine provoque l'arrêt du cycle cellulaire en phase Gl en régulant la transcription d'un autre gène, CIP 1/WAF1, qui code lui-même pour la protéine p2l. Cette p2l constitue un inhibiteur de la kinase cdk2 (qui permet normalement l'initiation de la réplication de l'ADN). P53, en provoquant l'arrêt du cycle en phase G1, permet aux cellules de réparer les dommages de l'ADN avant qu'elles ne s'engagent vers la réplication. Si les lésions sont trop importantes et les réparations insuffisantes, la p53 favorise l'élimination de la cellule en orientant le métabolisme cellulaire vers l'apoptose par inhibition, sans doute, de bcl-2 (par le biais de la transcription du gène bax). L'expression anormale de p53 empêche la cellulle de se suicider. Les mutations de p53, responsables de la non-fonctionnalité de la protéine et de son accumulation, constituent l'anomalie génique la plus courante des tumeurs de l'homme. Ces mutations permettent aux cellules tumorales de franchir le cap Gl, sans avoir corrigé les lésions de l'ADN.

D'autres molécules participent à la modulation de l'apoptose.
Ainsi, l'activation de la PKC inhibe, chez les cellules de type II, les effecteurs du DISC.
L'AIF (Apoptosis Inducing Factor) est une flavoprotéine qui induit la condensation du noyau et une chute de DYm.
Le c-FLIP (Cellular FLICE-Inhibitory Protein : FLICE = FADD-Like IL1b-Converting Enzyme ou caspase 8 : FADD = Fas-Associated Death Domain-containing protein) inhibe les interactions entre FADD et caspase 8.
La famille des facteurs de transcription NF-KB agissent en protégeant contre l'apoptose par l'intermédiaire de la régulation des gènes anti-apoptose.

XI-3/ Elimination des cellules apoptosées

La translocation de la phosphatidylsérine du feuillet interne de la membrane cellulaire à son feuillet externe est un signe précoce de l'apoptose. La présence de ce phospholipide à la surface de la cellule favoriserait la phagocytose des cellules en apoptose, à cause de récepteurs présents sur la membrane plasmique des macrophages. De façon analogue, interviendraient les sucres exposés par la désialilation, les récepteurs de la vitronectine, la thrombospondine, ... de la membrane des cellules apoptosées. Lorsque la cellule apoptotique est une cellule infectée par un virus, les cellules dendritiques hématopïétiques immatures peuvent phagocyter et induire une production de T cytotoxiques spécifiques du virus selon le mécanisme de la cross présentation.

XI-4/ Principales techniques d'étude de l'apoptose

Techniques morphologiques

En microscopie photonique conventionnelle : Les aspects sont peu spécifiques : cellules isolées présentant une forte condensation du noyau (noyau pycnotique) et du cytoplasme, fragmentation nucléaire et cytoplasmique, sans réaction inflammatoire de voisinage. Afin d'améliorer l'identification de l'apoptose, plusieurs techniques ont été développées.
L'une d'elles est une application de la biologie moléculaire permettant de repérer in situ les coupures de l'ADN. L'utilisation de la déoxynucléotidyltransférase (Tdt, pour Terminal déoxynucléotidyltransférase), permet d'ajouter des désoxyribonucléotides aux extrémités 3' OH terminales de l'ADN. Un système de révélation est associé à ces nucléotides (par exemple, déoxyuridine biotinylée mise en évidence par un complexe avidine-peroxydase) permettant de localiser les fragments d'ADN. Cette technique est nommée méthode TUNEL ( pour Tdt-mediated dUTP-biotin Nick End Labeling). Elle est applicable à des coupes, à des étalements, à la cytométrie en flux.
Une autre technique de révélation du processus d'apoptose repose sur la démonstration de la fragmentation de l'ADN.
Par exemple, après lyse cellulaire, extraction et purification de l'ADN passé dans le cytoplasme, la migration en gel d'électrophorèse fait apparaître l'aspect en "échelle" correspondant aux fragments multiples de 180 paires de bases.
Une variante mesure par cytométrie en flux la quantité d'ADN des noyaux ou fragments de noyaux marqués par l'iodure de propidium après lyse des cellules. L'image obtenue, lors de l'apoptose, est celle d'une hypoploïdie due à la perte des fragments d'ADN passés dans le cytoplasme.
Un procédé différent fait appel à des Ac monoclonaux spécifiques des ssDNA (ADN dénaturé). Un noyau normal ne contient pratiquement pas de fragments dénaturés d'ADN, or l'ADN des noyaux apoptotiques, même sans fragmentation nucléosomale, est le siège d'une instabilité thermique en présence de MgCl2 à pH neutre. Ainsi, seuls les noyaux des cellules en apoptose sont marqués par des Ac monoclonaux spécifiques des ssDNA si les coupes ou les cellules sont chauffées au préalable 6min à 100°C en présence de 4,5mM de MgCl2.
Une autre méthode cherche à révéler les très précoces chutes du DYm. Ainsi, le fluorochrome3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC6 émission dans le vert) pénètre peu dans la mitochondrie si le DYm est bas. On peut remplacer le DiOC6 par le fluorochrome 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazol-carbocyanine iodide (JC1) qui est incorporé sous forme monomérique (fluorescence verte à 527nm) dans les mitochondries avec bas DYm et sous formes agrégées (fluorescence rouge à 590nm) dans les mitochondries à DYm élevé.
Un procédé souvent utilisé en cytométrie en flux, fait appel simultanément à de l'annexine V fluorescente et à l'iodure de propidium. Les cellules au début de l'apoptose fixent, en présence de Ca++, l'annexine V au niveau de la phosphatidyl-sérine passée en surface. En revanche, leur noyau n'est pas marqué par l'iodure de propidium, car à ce moment la membrane plasmique est imperméable au colorant.
D'autres techniques correspondent à des méthodes immunocytochimiques évaluant l'expression de fas, des transglutaminases cytoplasmiques, de l'oncoprotéine bcl-2 ...