SPECTROSCOPIE INFRAROUGE
DES BIOMOLECULES
1 INTRODUCTION :
La spectroscopie du moyen infrarouge sur des biomolécules (bases nucléiques, carbohydrates, lipides et protéines) est utilisée dans le but d’obtenir plusieurs types d’informations dont: (1) la structure des biomolécules; (2) la nature des interactions intermoléculaires; (3) l’identification des groupements protonés (aspartate, glutamate, base de Schiff, etc...). La spectroscopie du moyen infrarouge est une des techniques les plus sensibles pour détecter de très faibles changements structuraux, tels que la formation de liaisons hydrogène, ou la protonation d’un groupement au sein des biomolécules. Cependant, tout le potentiel de la spectroscopie du moyen infrarouge reste limité à cause de l’enchevêtrement des bandes et de leur attribution.
2 APPROCHES FACILITANT L UTILISATION DE LA
SPECTROSCOPIE IR:
La méthode de déconvolution des bandes a simplifié l’analyse et la décomposition des bandes enchevêtrées [1]. La spectroscopie de différence, en mettant en évidence les bandes qui sont affectées par une perturbation chimique, physique ou par une illumination dans le cas d’une molécule photoactivable [2] etc.., conduit à une diminution du nombre de bandes. Par exemple, cette approche est employée pour la caractérisation des sites actifs des protéines photoactivables telles que la bactériorhodopsine (pompe à protons) [3,4] ou le centre photosynthétique [5]. La mesure de changements structuraux induits par une perturbation externe périodique peut être suivie à l’aide de la spectroscopie de modulation [6]. La spectroscopie de modulation permet d’observer sélectivement les changements structuraux en supprimant le spectre des composantes qui ne sont pas affectés par la perturbation externe. Le développement de la technique de reflectance interne en moyen IR [6,7] a facilité la mesure des spectres avec de la lumière polarisée sur des protéines insérées dans des membranes lipidiques bicouches. Les interactions entre les monocouches lipidiques et les protéines, à l interface air-eau ont été rendus possibles en utilisant la spectroscopie du moyen IR en reflectance externe [8,9].
3 SPECTROSCOPIE DE CORRELATION:
Parmi ces approches qui contribuent à faciliter l’interprétation des spectres moyen IR des biomolécules, la spectroscopie de corrélation peut être utilisée d’une manière synergique avec les autres méthodes. La spectroscopie de corrélation, permet de construire un spectre infrarouge en deux dimensions (2D IR). Elle améliore la résolution spectrale des pics en les dispersant dans les deux dimensions, facilitant l’analyse des informations qui ne sont pas toujours accessibles à partir du spectre unidimensionnel. D’autre part, la spectroscopie de corrélation n’utilise aucun paramètre mathématique pour construire les fonctions de corrélation contrairement aux méthodes de déconvolution qui nécessitent des paramètres qui ne sont pas toujours faciles à évaluer [1]. La corrélation sélective des pics rend possible, dans certains cas complexes, la distinction des interactions inter ou intra moléculaires.
Cette approche a été développée pour la première fois en 1990 [10], puis généralisé en 1993 [11] dans le domaine du moyen infrarouge. Par la suite, des nouveaux algorithmes qui se basent sur la transformation d’Hilbert, ont été développés, facilitant le calcul des fonctions de corrélation [12-14]. Cette méthode généralisée permet d’établir des corrélations entre une méthode spectroscopique et une autre technique. La première analyse hétérospectrale 2D en utilisant les spectres Raman et les spectres dans le domaine du proche IR a été publiée en 1996 [14]. De nombreux exemples d’applications de la spectroscopie de corrélation pour l’analyse des spectres complexes de macromolécules ont été publiés [15-23].
4 COMMENT PRODUIRE UN SPECTRE 2D IR ?:
Pour produire un spectre de corrélation 2D dans le domaine du moyen et du proche IR, il est nécessaire de perturber l’échantillon afin de générer une série de spectres mesurés à l’aide d’un spectromètre infrarouge commercial. Cette série de spectres est analysée par une fonction de corrélation synchrone qui identifie les bandes qui sont parfaitement corrélées entre elles. La perturbation extérieure au système peut être produite par une réaction chimique ou une variation de pH, de température, etc.... Par exemple dans le cas des protéines membranaires, ces perturbations peuvent être produites en présence ou non de lipides, stérols, etc...) ou de substrats (pour le cas des enzymes). L’objectif ultime est de déterminer la nature des groupements qui sont impliqués dans ces interactions, afin de mieux comprendre la structure de la protéine et dans le cas échéant le fonctionnement de l’enzyme.
Alternativement, le groupe de Hochstrasser a réussi à obtenir un spectre 2D IR en utilisant deux lasers pulsés ultra rapides permettant d’identifier directement des couplages entre des groupements carbonyles de la chaîne peptidique d’un cyclopeptide. Actuellement, un tel spectromètre n’est pas accessible sur le marché. La réalisation d’un tel spectromètre pose des difficultés techniques que seuls quelques rares laboratoires de recherche dans le monde peuvent résoudre. Cette nouvelle approche, qui autorise une résolution temporelle de l’ordre de 1 ps ouvre de nouvelles perspectives pour la détermination des structures des macromolécules en des temps relativement courts [24].
5 INFORMATIONS NOUVELLES APPORTEES PAR LA SPECTROSCOPIE 2D IR:
Afin d’illustrer le potentiel de la spectroscopie 2D IR pour l’attribution des bandes infrarouge, un exemple de résultats obtenu sur le poly-(L)-lysine est présenté [25]. Ce polypeptide a été incubé dans une atmosphère d’humidité relative de 80 %, dont une partie est déshydraté en chauffant de deux degrés à partir de 28°C. La déshydratation du poly-(L)-lysine induit la formation de feuillet plissé b au détriment des structures de type a-hélice en quelques minutes. Ainsi la perturbation externe consiste en une variation périodique de température autour de 28°C de +/- 2°C produisant une déshydration, puis une rehydradation du polypeptide. Cette perturbation donne lieu à un changement périodique de conformation du poly-(L)-lysine qui est suivi au moyen de la spectroscopie infrarouge. La série de spectres est ensuite analysée par une fonction de corrélation synchrone donnant lieu à un spectre 2D ( Figure 1).
Fig. 1 Représentation des maxima de la fonction de corrélation d’un film de poly-(L)-lysine affecté par une variation de température. Les pics sur la diagonale reflètent les positions des bandes sur le spectre IR. Les pics en dehors de la diagonale reflètent les corrélations entre les pics. Adaptation de la figure tirée de la référence 25.
Les pics sur la diagonale correspondent aux pics du spectre infrarouge de l’échantillon affecté par la perturbation, tandis que les pics en dehors de la diagonale reflètent les corrélations. Il est possible de corréler sans ambiguïté les bandes dans la région comprise entre 1500 et 1400 cm-1 associée aux modes de vibration amide II’ (région du spectre infrarouge peu documentée), en se basant sur l’attribution très connue de la région 1700 et 1600 cm-1 associée aux modes de vibration amide I’. En particulier il a été possible d’attribuer les bandes correspondant respectivement à la structure feuillets plissés b (bande située à 1448 cm-1) et à la structure a hélice (bande localisée à 1468 cm-1) dans la région amide II’ [25]. Une bande située à 1608 cm-1 a été mise en évidence sur le spectre 2D IR alors qu’elle était difficilement observable sur le spectre unidimensionnel. Cette bande n’est pas corrélée avec les trois bandes localisées à 1448 cm-1, 1615 cm-1 et à 1684 cm-1 (caractéristiques de la structure feuillets plissés b). Ce résultat suggère la présence d’une autre type de structure, qui a été attribuée à la structure de type feuillets plissés b hydraté. Cette conformation du polypeptide peut correspondre à un état intermédiaire entre la structure a hélice et la structure du feuillet plissé b du polypeptide.
6 PERSPECTIVES:
La spectroscopie de corrélation 2D IR contribue à améliorer l’attribution des bandes enchevêtrées et à rendre plus fiable l’interprétation des spectres infrarouge des biomolécules. Cette approche peut être non seulement utilisée pour caractériser les changements de structures des biomolécules produits au cours d’une perturbation physique ou chimique périodique mais également au cours des processus irréversibles ou cinétiques.
7 REFERENCES :
[1] W. K. Surewicz, H. H. Mantsch and D. Chapman. Biochemistry (1993) 32 389.
[2] W. Mäntele (1993) TIBS 18 197.
[3] F. Siebert Methods in Enzymol. (1995) 246 501.
[4] M. S. Braiman and K. J. Rotschild Annu. Rev. Biophys. Chem. (1988) 17 541.
[5] E. Nabedryk, B. A. Tavitian, W. Mäntele and W. Kreutz, J. Breton Progress in Photosynthesis Research, Proc. 7th. Int. Congr. Photosynth., Providence RI. (Ed. J. Biggins) Dordrecht, The Netherlands 1986; p 177.
[6] U. P. Fringeli. (1992) In situ Infrared internal reflection membrane spectroscopy. In international Reflection spectroscopy Theory and Applications. (Ed. F. M. Mirabella). Marcel Dekker Inc. NY 1992; p. 255.
[7] E. Goormaghtigh, V. Cabiaux, V. and J. M. Ruysschaert. (1994) Determination of soluble and membrane protein structure by Fourier transform infrared spectroscopy 1. Assignments and Model compounds in Subcellular Biochemistry, in Physical Methods in the Study of Biomembranes (Hilderson, H. J. & Ralston, G. B., ed.) Plenum Press, NY. Vol 23, p 329.
[8] T. Buffeteau, B. Desbat and J. Turlet. Biophys. J. (1991) 76 1639.
[9] R. A. Dluhy J. Phys. Chem. (1986) 90 1373.
[10] I. Noda Applied Spectroscopy (1990) 44 550.
[11] I. Noda Applied Spectroscopy (1993) 47 1329.
[12] Y. Liu, Y. Ozaki and I. Noda. J. Phys. Chem. (1996) 100 7326.
[13] I. Noda, Y.Liu and Y. Ozaki. J. Phys. Chem. (1996) 100 8665.
[14] I. Noda, Y.Liu, and Y. Ozaki. J. Phys. Chem. (1996) 100 8674.
[15] Y. Osaki and I. Noda. J. Near Infrared Spectrosc. (1996) 4 85.
[16] Y. Ozaki, Y. Liu, and I. Noda. Macromolecules (1997) 30 7326.
[17] Y. Ozaki, Y. Liu and I. Noda. Appl. Spectr. (1997) 51 526.
[18] Y. Wang, K. Murayama, Y. Myojo, R. Tsenkova, N. Hayashi and Y. Ozaki. J. Phys. Chem. (1998) 102 6655.
[19] S. J. Gadaleta, A. Gericke, A. L. Boskey and R. Mendelsohn. Biospectroscopy (1996) 2 353.
[20] A. Gericke, S.J. Gadaleta, A. L. Boskey and R. Mendelsohn. Biospectroscopy (1996) 2 341.
[21] A. Nabet and M. Pezolet. Appl. Spect. (1997) 51 466.
[22] C. P. Schultz, H. Fabian and H. H. Mantsch. Biospectroscopy (1998) 4 S19.
[23] N. L. Sefara, N. P. Magtoto and H. H. Richardson. Appl. Spectrosc. (1997) 51 536.
[24] P. Hamm, M. Lim, W. F. DeGrado and R. M. Hochstrasser. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96 2036.
[25] M. Müller, R. Buchet and U. P. Fringeli. J. Phys. Chem. (1996) 100 10810.
SPECTROSCOPIE INFRAROUGE DES BIOMOLECULES
1 INTRODUCTION:
La spectroscopie du moyen infrarouge sur des biomolécules (bases nucléiques, carbohydrates, lipides et protéines) est utilisée dans le but d’obtenir plusieurs types d’informations dont: (1) la structure des biomolécules; (2) la nature des interactions intermoléculaires; (3) l’identification des groupements protonés (aspartate, glutamate, base de Schiff, etc...). La spectroscopie du moyen infrarouge est une des techniques les plus sensibles pour détecter de très faibles changements structuraux, tels que la formation de liaisons hydrogène, ou la protonation d’un groupement au sein des biomolécules. Cependant, tout le potentiel de la spectroscopie du moyen infrarouge reste limité à cause de l’enchevêtrement des bandes et de leur attribution.
2 APPROCHES FACILITANT L UTILISATION DE LA
SPECTROSCOPIE IR:
La méthode de déconvolution des bandes a simplifié l’analyse et la décomposition des bandes enchevêtrées [1]. La spectroscopie de différence, en mettant en évidence les bandes qui sont affectées par une perturbation chimique, physique ou par une illumination dans le cas d’une molécule photoactivable [2] etc.., conduit à une diminution du nombre de bandes. Par exemple, cette approche est employée pour la caractérisation des sites actifs des protéines photoactivables telles que la bactériorhodopsine (pompe à protons) [3,4] ou le centre photosynthétique [5]. La mesure de changements structuraux induits par une perturbation externe périodique peut être suivie à l’aide de la spectroscopie de modulation [6]. La spectroscopie de modulation permet d’observer sélectivement les changements structuraux en supprimant le spectre des composantes qui ne sont pas affectés par la perturbation externe. Le développement de la technique de reflectance interne en moyen IR [6,7] a facilité la mesure des spectres avec de la lumière polarisée sur des protéines insérées dans des membranes lipidiques bicouches. Les interactions entre les monocouches lipidiques et les protéines, à l interface air-eau ont été rendus possibles en utilisant la spectroscopie du moyen IR en reflectance externe [8,9].
3 SPECTROSCOPIE DE CORRELATION:
Parmi ces approches qui contribuent à faciliter l’interprétation des spectres moyen IR des biomolécules, la spectroscopie de corrélation peut être utilisée d’une manière synergique avec les autres méthodes. La spectroscopie de corrélation, permet de construire un spectre infrarouge en deux dimensions (2D IR). Elle améliore la résolution spectrale des pics en les dispersant dans les deux dimensions, facilitant l’analyse des informations qui ne sont pas toujours accessibles à partir du spectre unidimensionnel. D’autre part, la spectroscopie de corrélation n’utilise aucun paramètre mathématique pour construire les fonctions de corrélation contrairement aux méthodes de déconvolution qui nécessitent des paramètres qui ne sont pas toujours faciles à évaluer [1]. La corrélation sélective des pics rend possible, dans certains cas complexes, la distinction des interactions inter ou intra moléculaires.
Cette approche a été développée pour la première fois en 1990 [10], puis généralisé en 1993 [11] dans le domaine du moyen infrarouge. Par la suite, des nouveaux algorithmes qui se basent sur la transformation d’Hilbert, ont été développés, facilitant le calcul des fonctions de corrélation [12-14]. Cette méthode généralisée permet d’établir des corrélations entre une méthode spectroscopique et une autre technique. La première analyse hétérospectrale 2D en utilisant les spectres Raman et les spectres dans le domaine du proche IR a été publiée en 1996 [14]. De nombreux exemples d’applications de la spectroscopie de corrélation pour l’analyse des spectres complexes de macromolécules ont été publiés [15-23].
4 COMMENT PRODUIRE UN SPECTRE 2D IR ?:
Pour produire un spectre de corrélation 2D dans le domaine du moyen et du proche IR, il est nécessaire de perturber l’échantillon afin de générer une série de spectres mesurés à l’aide d’un spectromètre infrarouge commercial. Cette série de spectres est analysée par une fonction de corrélation synchrone qui identifie les bandes qui sont parfaitement corrélées entre elles. La perturbation extérieure au système peut être produite par une réaction chimique ou une variation de pH, de température, etc.... Par exemple dans le cas des protéines membranaires, ces perturbations peuvent être produites en présence ou non de lipides, stérols, etc...) ou de substrats (pour le cas des enzymes). L’objectif ultime est de déterminer la nature des groupements qui sont impliqués dans ces interactions, afin de mieux comprendre la structure de la protéine et dans le cas échéant le fonctionnement de l’enzyme.
Alternativement, le groupe de Hochstrasser a réussi à obtenir un spectre 2D IR en utilisant deux lasers pulsés ultra rapides permettant d’identifier directement des couplages entre des groupements carbonyles de la chaîne peptidique d’un cyclopeptide. Actuellement, un tel spectromètre n’est pas accessible sur le marché. La réalisation d’un tel spectromètre pose des difficultés techniques que seuls quelques rares laboratoires de recherche dans le monde peuvent résoudre. Cette nouvelle approche, qui autorise une résolution temporelle de l’ordre de 1 ps ouvre de nouvelles perspectives pour la détermination des structures des macromolécules en des temps relativement courts [24].
5 INFORMATIONS NOUVELLES APPORTEES PAR LA SPECTROSCOPIE 2D IR:
Afin d’illustrer le potentiel de la spectroscopie 2D IR pour l’attribution des bandes infrarouge, un exemple de résultats obtenu sur le poly-(L)-lysine est présenté [25]. Ce polypeptide a été incubé dans une atmosphère d’humidité relative de 80 %, dont une partie est déshydraté en chauffant de deux degrés à partir de 28°C. La déshydratation du poly-(L)-lysine induit la formation de feuillet plissé b au détriment des structures de type a-hélice en quelques minutes. Ainsi la perturbation externe consiste en une variation périodique de température autour de 28°C de +/- 2°C produisant une déshydration, puis une rehydradation du polypeptide. Cette perturbation donne lieu à un changement périodique de conformation du poly-(L)-lysine qui est suivi au moyen de la spectroscopie infrarouge. La série de spectres est ensuite analysée par une fonction de corrélation synchrone donnant lieu à un spectre 2D ( Figure 1).
Fig. 1 Représentation des maxima de la fonction de corrélation d’un film de poly-(L)-lysine affecté par une variation de température. Les pics sur la diagonale reflètent les positions des bandes sur le spectre IR. Les pics en dehors de la diagonale reflètent les corrélations entre les pics. Adaptation de la figure tirée de la référence 25.
Les pics sur la diagonale correspondent aux pics du spectre infrarouge de l’échantillon affecté par la perturbation, tandis que les pics en dehors de la diagonale reflètent les corrélations. Il est possible de corréler sans ambiguïté les bandes dans la région comprise entre 1500 et 1400 cm-1 associée aux modes de vibration amide II’ (région du spectre infrarouge peu documentée), en se basant sur l’attribution très connue de la région 1700 et 1600 cm-1 associée aux modes de vibration amide I’. En particulier il a été possible d’attribuer les bandes correspondant respectivement à la structure feuillets plissés b (bande située à 1448 cm-1) et à la structure a hélice (bande localisée à 1468 cm-1) dans la région amide II’ [25]. Une bande située à 1608 cm-1 a été mise en évidence sur le spectre 2D IR alors qu’elle était difficilement observable sur le spectre unidimensionnel. Cette bande n’est pas corrélée avec les trois bandes localisées à 1448 cm-1, 1615 cm-1 et à 1684 cm-1 (caractéristiques de la structure feuillets plissés b). Ce résultat suggère la présence d’une autre type de structure, qui a été attribuée à la structure de type feuillets plissés b hydraté. Cette conformation du polypeptide peut correspondre à un état intermédiaire entre la structure a hélice et la structure du feuillet plissé b du polypeptide.
6 PERSPECTIVES:
La spectroscopie de corrélation 2D IR contribue à améliorer l’attribution des bandes enchevêtrées et à rendre plus fiable l’interprétation des spectres infrarouge des biomolécules. Cette approche peut être non seulement utilisée pour caractériser les changements de structures des biomolécules produits au cours d’une perturbation physique ou chimique périodique mais également au cours des processus irréversibles ou cinétiques.
7 Références:
[1] W. K. Surewicz, H. H. Mantsch and D. Chapman. Biochemistry (1993) 32 389.
[2] W. Mäntele (1993) TIBS 18 197.
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[6] U. P. Fringeli. (1992) In situ Infrared internal reflection membrane spectroscopy. In international Reflection spectroscopy Theory and Applications. (Ed. F. M. Mirabella). Marcel Dekker Inc. NY 1992; p. 255.
[7] E. Goormaghtigh, V. Cabiaux, V. and J. M. Ruysschaert. (1994) Determination of soluble and membrane protein structure by Fourier transform infrared spectroscopy 1. Assignments and Model compounds in Subcellular Biochemistry, in Physical Methods in the Study of Biomembranes (Hilderson, H. J. & Ralston, G. B., ed.) Plenum Press, NY. Vol 23, p 329.
[8] T. Buffeteau, B. Desbat and J. Turlet. Biophys. J. (1991) 76 1639.
[9] R. A. Dluhy J. Phys. Chem. (1986) 90 1373.
[10] I. Noda Applied Spectroscopy (1990) 44 550.
[11] I. Noda Applied Spectroscopy (1993) 47 1329.
[12] Y. Liu, Y. Ozaki and I. Noda. J. Phys. Chem. (1996) 100 7326.
[13] I. Noda, Y.Liu and Y. Ozaki. J. Phys. Chem. (1996) 100 8665.
[14] I. Noda, Y.Liu, and Y. Ozaki. J. Phys. Chem. (1996) 100 8674.
[15] Y. Osaki and I. Noda. J. Near Infrared Spectrosc. (1996) 4 85.
[16] Y. Ozaki, Y. Liu, and I. Noda. Macromolecules (1997) 30 7326.
[17] Y. Ozaki, Y. Liu and I. Noda. Appl. Spectr. (1997) 51 526.
[18] Y. Wang, K. Murayama, Y. Myojo, R. Tsenkova, N. Hayashi and Y. Ozaki. J. Phys. Chem. (1998) 102 6655.
[19] S. J. Gadaleta, A. Gericke, A. L. Boskey and R. Mendelsohn. Biospectroscopy (1996) 2 353.
[20] A. Gericke, S.J. Gadaleta, A. L. Boskey and R. Mendelsohn. Biospectroscopy (1996) 2 341.
[21] A. Nabet and M. Pezolet. Appl. Spect. (1997) 51 466.
[22] C. P. Schultz, H. Fabian and H. H. Mantsch. Biospectroscopy (1998) 4 S19.
[23] N. L. Sefara, N. P. Magtoto and H. H. Richardson. Appl. Spectrosc. (1997) 51 536.
[24] P. Hamm, M. Lim, W. F. DeGrado and R. M. Hochstrasser. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96 2036.
[25] M. Müller, R. Buchet and U. P. Fringeli. J. Phys. Chem. (1996) 100 10810.